Se presenta un protocolo que permite ver y para evaluar cuantitativamente la morfología del árbol dendrítico de las células de Purkinje individuales cultivadas en cultivos de cortes organotípicos cerebelosos. Este protocolo tiene como objetivo promover estudios sobre los mecanismos de desarrollo de Purkinje células dendríticas.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
El análisis de la morfología de células dendríticas Purkinje en cultivos de corte organotípicos
En este artículo
Resumen
Resumen
Células de Purkinje son un sistema de modelo atractivo para el estudio de desarrollo dendrítico, porque tienen un árbol dendrítico impresionante que es estrictamente orientada en el plano sagital y se desarrolla principalmente en el periodo postnatal en roedores pequeños 3. Además, los anticuerpos se encuentran disponibles varios que selectivamente y de forma intensiva marcar células de Purkinje, incluyendo todos los procesos, con anti-Calbindin D28K siendo el más ampliamente utilizado. Para la visualización de las dendritas en las células vivas, los ratones que expresan EGFP selectivamente en las células de Purkinje 11 están disponibles a través de los laboratorios Jackson. Organotípicos culturas cerebelosos rebanada células permiten una fácil manipulación experimental de desarrollo Purkinje células dendríticas porque la mayor parte de la expansión dendríticas del árbol dendrítico de células de Purkinje que de hecho ocurre durante el período de cultivo 4. Presentamos aquí un protocolo corto, fiable y fácil para la visualización y el análisis de la morfología dendrítica de las células de Purkinje crecido en organotypic cultivos de cortes cerebelosos. Para muchos fines, una evaluación cuantitativa del árbol dendrítico de células de Purkinje es deseable. Nos centramos aquí en dos parámetros, tamaño del árbol dendrítico y los números de punto de ramificación, que puede ser rápidamente y fácilmente determinadas a partir de anti-calbindina cultivos teñidos rebanada cerebelosos. Estos dos parámetros obtener una medida fiable y sensible de los cambios del árbol de células dendríticas Purkinje. Usando el ejemplo de los tratamientos con la proteína quinasa C PMA (PKC) y el activador del receptor de glutamato metabotrópico 1 (mGluR1) se demuestra cómo las diferencias en el desarrollo dendrítico se visualizan y evaluó cuantitativamente. La combinación de la presencia de un árbol dendrítico extensa, los métodos selectivos y de inmunotinción intensa, cultivos organotípicos rebanada que cubren el período de crecimiento dendrítico y un modelo de ratón con expresión de células de Purkinje EGFP específico hacer las células de Purkinje un sistema modelo de gran alcance para revelar los mecanismos de la dendríticas desarrollo.
Protocolo
1. Configuración de organotípicos cultivos de cortes cerebelosos
Cultivos cerebelares rebanada se preparan a partir día postnatal 8 P (8) crías de ratón utilizando el método de incubación estática 10. En nuestro laboratorio utilizamos B6CF1 ratones. En algunos experimentos los ratones transgénicos también se utilizaron que expresan EGFP selectivamente en las células de Purkinje. La preparación de cultivos de corte es de unos 30 minutos por cada ratón cachorro, es decir, 3 horas para una camada de seis crías de ratón. Todos los pasos se llevan a cabo en condiciones estériles en un banco de trabajo de flujo laminar con instrumentos....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Los métodos aquí presentados permiten estudiar el desarrollo de células de Purkinje dendríticas en cultivos de cortes organotípicos cerebelares y para evaluar cuantitativamente la expansión Purkinje de células dendríticas mediante la medición de tamaño de árbol dendrítico y el número de puntos de ramificación dendríticas. Por supuesto, un análisis cuantitativo más amplio y sofisticado de las dendritas de células de Purkinje es posible, por ejemplo, determinando la longitud dendrítica total, realizando un análisis de Sho.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Directiva Europea Comunidades Consejo, de 24 de noviembre de 1986 (86/609/EEC) y fueron revisados y autorizados por las autoridades suizas. Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Universidad de Basilea, del Departamento de Biomedicina, y la Swiss National Science Foundation (31003A-116624).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| Insertos de cultivo de tejidos | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | Los PICMORG50 insertos tienen un borde bajo y permitir la visualización de las culturas vivas en un microscopio |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal de Eagle Meidum | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| El suero de caballo | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Forbol 12-myristaTE-13-acetato (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS) -3,5-dihidroxi-fenilglicina (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Lucha contra NeuN, clon A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| De conejo anti-GFP | Abcam | Ab290 |
Referencias
- Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
- Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
