Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

1. Generación de líneas celulares: pMEP4 transfección / expresión

1. Transfectar células con el vector de expresión pMEP4 y seleccionar con 100 g de higromicina B / ml (Roche) hasta que todas las células transfectadas simuladas se han matado. El plásmido pMEP4 se mantiene episomalmente lo que no hay necesidad de aislar clones específicos.
2. Las células que contienen el vector pMEP4 puede ser inducida por tratamiento con 10 CdCl ₂ mM durante 16 horas. Expresión y la inducibilidad debe ser confirmada en una pequeña escala antes de la amplificación de las líneas celulares. La proteína TAP-etiquetados puede ser fácilmente detectado como los dominios de la proteína G se unen a los anticuerpos de casi todas las especies. Para los grandes purificaciones normalmente 10 confluentes 175 cm ² frascos de células son obligatorios. Esto equivale a aproximadamente 2 X10 ⁸ células que expresan.

2. De preparación de células lisado

1. Raspe las células en PBS y se combinan en un tubo de 50 ml de una sola. Spin 1200X gfo 5 minutos (esto debería resultar en 2-3 ml de células empaquetadas para empezar, lo que reduce a aproximadamente 1,5 ml después del lavado).
2. Se lavan las células tres veces en PBS enfriado en hielo (50 ml cada vez).
3. Lisar las células en 5 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 125 mM, glicerol al 5%, 0,2% de NP-40, 1,5 mM de MgCl _2, 25 mM de NaF, 1 mM Na ₃ VO ₄ y el inhibidor de proteasa ). Nota: NaF, Na ₃ VO ₄ y los inhibidores de la proteasa debe añadirse fresco. Pipetear arriba y hacia abajo 10 veces antes de dejar durante 5 minutos en hielo. Veces jeringa hacia arriba y hacia abajo 5-10 usando una aguja roma antes de salir de nuevo en hielo durante 5 minutos en hielo. Repetir su inyección y se deja durante otros 5 minutos en hielo.
4. Congelación-descongelación del lisado dos veces (hielo líquido N / ₂ o seco y etanol). No permita que la muestra para llegar a más de 4 ° C. Nota: se puede almacenar la muestra a -80 ° C hasta que tenga tiempo para procesar.
5. Alícuotas de la muestra en tubos de 1,5 ml y eliminar las células no lisadas y debris por centrifugación (10 minutos a 4 ° C, 16.000 xg).
6. Recuperar sobrenadante, se combinan en un tubo Falcon de 15 ml y (opcionalmente) pasan a través de unos 0,45 m de filtro antes de tomar una muestra de 20 l para la cuantificación de proteínas rendimiento. Eliminar un ulterior 50 l alícuota para su posterior análisis (Muestra 1).

3. La unión a IgG de conejo-agarosa

(Nota: Todos los giros deben llevarse a cabo a 1200X g en una centrífuga refrigerada a 4 ° C durante 1 minuto, a menos que se indique lo contrario)

1. Resuspender la IgG de conejo-agarosa solución (Sigma-Aldrich) por agitación botella. Tomar 380 l de IgG de agarosa (utilizando un corte de punta de la pipeta 1 ml) y retirar el envío / solución conservante por centrifugación durante 1 minuto. Lavar la agarosa tres veces en tampón de lisis frío (4 ° C) usando centrifugación para aclarar. El rendimiento final de agarosa debe ser de aproximadamente 250 l de perlas envasados.
2. Añadir el lisado celular desaparecido de 2,6 (en una tina de 15 ml Falcone) el lavado de conejo IgG de agarosa y se incuba durante 3 horas (o durante la noche) a 4 ° C usando un mezclador giratorio.
3. Derivado establecen las perlas de agarosa durante 5 minutos a 4 ° C y separar el sobrenadante para su posterior análisis (Muestra 2). Nota: El TAP etiquetado de proteínas debe ahora estar asociados con las cuentas.

4. Escisión de la proteasa TEV

(Nota: Todos los giros deben llevarse a cabo a 1200X g en una centrífuga refrigerada a 4 ° C durante 1 minuto, a menos que se indique lo contrario)

1. Lavar las perlas de agarosa IgG de conejo tres veces en tampón de lisis frío (4 ° C) mediante centrifugación para aclarar (nota: el tampón de lisis no debe contener inhibidores de la proteasa). Se debe tener cuidado de no eliminar o perder los granos durante los pasos de lavado.
2. Se lavan las perlas de otras dos veces con tampón de escisión VET-proteasa (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), NaCl 100 mM, y 0,2% NP-40) utilizando centrifugación para aclarar. Después del último lavado retire con cuidado todas las liquid de las perlas.
3. Prepare una mezcla de la proteasa TEV división, para cada muestra se incluyen 467,5 l H ₂ O, 25 l 20x TEV buffer (Invitrogen), 5 ml DTT 0,1 M y 2,5 l (25 U) de la proteasa TEV (Invitrogen). Añadir 500 l de esta mezcla de escisión VET a cada muestra de perlas envasados ​​y transferir toda la mezcla a un 1,7 ml de pre-lubricado tubo (Costar). Antes de la incubación eliminar una parte alícuota de 30 l para su posterior análisis (Muestra 3).
4. Incubar la reacción proteasa TEV durante la noche a 4 ° C usando un mezclador giratorio. Nótese que tiempos más cortos incubaciones se pueden utilizar dependiendo de la naturaleza de la proteína cebo y la accesibilidad del sitio de escisión de la proteasa VET pero el tiempo de incubación mínimo debe ser determinado empíricamente.

5. La unión a estreptavidina inmovilizada Ultralink Plus cuentas

(Nota: Todos los giros deben llevarse a cabo a 1200X g en una centrífuga refrigerada a 4 ° C durante 1 minuto, a menos que se indique lo contrario)

6. Biotina elución del péptido y proteína de unión de estreptavidina cebo

(Nota: Todos los giros deben llevarse a cabo a 1200X g en una centrífuga refrigerada a 4 ° C durante 1 minuto, a menos que se indique lo contrario)

1. Eluir proteínas etiquetadas de las perlas de estreptavidina mediante la adición de 500 l de PBS: biotina (1 mM de D-biotina) y la incubación a 4 ° C durante 3 horas (o durante la noche) usando un mezclador giratorio.
2. Gira por las perlas de estreptavidina durante 5 minutos a 4 ° C y retirar el sobrenadante a un tubo de 1,5 ml de pre-lubricadas (Nota: esta es la muestra final / de elución (Ejemplo 7).
3. Añadir otra Biotina 500 l: PBS a las perlas de estreptavidina restantes y se incuba a 4 ° C durante 2-3 horas (o durante la noche) usando un mezclador giratorio.
4. Returba el paso 6.2 y combinar los dos eluciones (Ejemplo 7). Este elución final puede ser almacenado a -80 ° C.
5. Para evaluar la eficiencia de la elución de la biotina, congelar las cuentas de estreptavidina restantes y hervir más tarde en tampón de muestra SDS (Muestra 8) (recomendaciones: LaneMarker 5x tampón de muestra de la reducción de Fisher).

7. La concentración de proteínas

1. El eluido final (Ejemplo 7) tiene que ser concentrado antes de su análisis, debido a la baja concentración de proteínas y el volumen relativamente alto. Esto se puede lograr utilizando de bajo peso molecular (menos de 5 kDa) columnas Vivaspin spin (Vivascience). Por objeto concentrar el volumen a menos de 100 l. Esta muestra final se puede hervir y se almacena en el búfer de la proteína de la muestra (recomendaciones: LaneMarker 5x tampón de muestra de la reducción de Fisher).

8. Análisis

1. Las muestras 1-8 se puede analizar por Western blot para determinar la eficacia de tirar hacia abajo. Nota: La mayoría de los anticuerpos secundarios seuna reacción cruzada con los dominios de la proteína G de la proteína de fusión, pero esto se elimina después de la escisión de la proteasa VET.
2. Ejemplo 7 pueden ser analizados por 1D o 2D SDS-PAGE. La tinción puede realizarse usando plata o de Coomassie (recomendaciones: tinción SilverQuest plata coloidal y kits de tinción con azul Coomassie de Invitrogen). Identificación de proteínas se puede realizar utilizando espectrometría de masas.

9. Los resultados representativos

Un ejemplo de 1D análisis SDS-PAGE de la elución final (Ejemplo 7) de este protocolo para identificar parejas de unión de eIF4E TAP etiquetado se proporciona en la Figura 2. Este gel representativo refleja la naturaleza compleja y abundante de las interacciones con otras proteínas eIF4E en la célula. La comparación con el control negativo también se muestra en la Figura 2, generada a partir de una línea celular que expresa sólo la etiqueta TAP, ilustra la especificidad de este eIF4E cebo desplegable. En este ejemplo el 15% de la elución final concentrada (Muestra7) se analizó por SDS-PAGE 1D utilizando comercialmente disponibles prefabricados geles de gradiente antes de ser teñidos utilizando el kit de tinción de plata Silverquest de Invitrogen.

Típicamente 50-85% de la restante elución concentrado final (Ejemplo 7) se analiza con Coomassie coloidal mancha (Invitrogen). Las muestras (rodajas de gel o bandas) de todo el carril se extrajeron luego y se analizaron por espectrometría de masas.

Las proteínas identificadas en el eIF4E pull-down se filtraron en contra de las parejas de unión del control negativo para identificar no específicos asociados vinculantes. Las proteínas finales identificados utilizando este proceso de eIF4E TAP etiquetado puede verse en la Figura 2, que es representativo de las proteínas normales identificados utilizando esta técnica. Además, un número de las subunidades eIF3 También se han detectado (datos no presentados).

Figura 1. Esquema de laconjuntamente procedimiento de purificación por afinidad. El tándem de seis pasos de purificación de afinidad (TAP) de protocolo implica la generación de líneas celulares, la lisis celular, IgG de conejo de agarosa inmuno-precipitación, TEV división de la proteasa, estreptavidina purificación por afinidad de cuentas y, finalmente elución biotina.

Figura 2. Tándem purificación por afinidad de la proteína murina eIF4E. Interactuar socios de la N terminal TAP etiquetados eIF4E se purificaron a partir de células eucariotas HEK293 utilizando el protocolo adjunto. Una fracción del 20% de la elución final (Ejemplo 7) se analizó por SDS-PAGE en un gel de gradiente prefabricado 4-12% (PAT-eIF4E carril). Un análisis equivalente se llevó a cabo para la etiqueta por sí solo (carril TAP). Las proteínas se identificaron mediante la tinción de plata. Las proteínas posteriormente identificados por espectrometría de masas de la misma muestra se destacan en este gel.
Abreviaturas: eIF4G; iniciación de la traducción eucariótica factor de 4 gamma, PABP, proteína poli vinculante, eIF4A: factor de iniciación de la traducción eucariótica 4 alfa, SBP-eIF4E, la proteína PAT cebo restante que contiene el péptido estreptavidina vinculante fusionado con el factor 4E traducción eucariótico de iniciación, 4EBPs; eucariótico de iniciación de traducción 4E factor de unión proteínas, eIF4eNiF1l eucariótico de iniciación de traducción factor de factor nuclear de importación 4E 1, PAS, el péptido estreptavidina restante de unión del péptido TAP contenga restos de TEV.

No hay conflictos de interés declarado.