El organismo modelo C. elegans Utiliza fluido pseudocoelomic como un sistema circulatorio pasiva. Ensayo directo de este fluido no ha sido posible anteriormente. Aquí se presenta una técnica novedosa de ensayo directamente en el espacio extracelular, y utilizar las señales sistémicas silenciamiento durante una respuesta de RNAi como una prueba de principio ejemplo.
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Artículo de método
Vampiric Aislamiento de líquido extracelular de
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Resumen
Resumen
El organismo genéticamente tractable modelo C. elegans ha ayudado a comprender un gran número de cuestiones biológicas, habilitado por su corto tiempo de generación, facilidad de crecimiento y el tamaño pequeño. Este pequeño tamaño, sin embargo, ha rechazado un número de enfoques técnicos encontrados en otros sistemas modelo. Por ejemplo, las transfusiones de sangre en los sistemas de mamíferos y las técnicas de injerto en plantas permiten hacer preguntas de composición del sistema circulatorio y señalización. El sistema circulatorio de la lombriz, el pseudoceloma, ha sido hasta hace poco imposible de ensayo directamente. Para responder a las preguntas de la señalización intercelular y el sistema circulatorio composición C. investigadores elegans tradicionalmente han convertido a un análisis genético, de célula / tejido de rescate específico, y el análisis de mosaico. Estas técnicas proporcionan un medio para inferir lo que está pasando entre las células, pero no son universalmente aplicables en la identificación y caracterización de moléculas extracelulares. Aquí les presentamos una neWLY técnica desarrollada a ensayo directamente el fluido pseudocoelomic de C. elegans. La técnica comienza con cualquiera de manipulación genética o física para aumentar el volumen de fluido extracelular. Después, los animales se someten a una técnica de microinyección vampírica inversa usando una plataforma de microinyección que permite un control fino balance de la presión. Después del aislamiento de fluido extracelular, el líquido recogido puede ensayarse por transferencia a otros animales o por medios moleculares. Para demostrar la eficacia de esta técnica se presenta un enfoque detallado para el ensayo de un ejemplo específico de moléculas de señalización extracelular, durante un largo dsRNA de respuesta RNAi. Aunque la caracterización de RNAi sistémico es una prueba de principio ejemplo, vemos esta técnica como ser adaptable para responder una variedad de preguntas de la composición del sistema circulatorio y de señalización.
Protocolo
1. Preparación de los materiales
El material necesario para la microinyección vampírica inversa es similar a la requerida para las técnicas de microinyección estándar utilizados para hacer transgénico C. elegans cepas 1. Aunque algunos reactivos (por ejemplo, placas de ensayo) se hizo el día de la transferencia experimental, muchos de los materiales debe ser coordinada preparado durante un periodo de 8 días (véase la Tabla 1 para una mesa de tiempo). Como tal, es importante planificar de antemano con cuidado al usar esta técnica (para los reactivos y equipos necesarios ver Tabla 2).
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Discusión
Hemos presentado aquí un nuevo método que permite el aislamiento y la caracterización de líquido extracelular del organismo modelo C. elegans. La técnica comienza con la manipulación genética o física de gusanos donantes a incrementar su volumen total de fluido extracelular. Fluido extracelular se aísla a continuación usando una técnica de microinyección modificada. Los gusanos están montados para la microinyección usando almohadillas secas de agarosa para mantener los gusanos inmóvil durante el procedimiento. .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Nos gustaría reconocer la naturaleza de colaboración del laboratorio de Hunter, y darles las gracias por el debate útil y la asistencia que han hecho del desarrollo de esta técnica posible y divertido. Nos gustaría dar las gracias a Nigel Delaney y el Caenorhabditis Centro de Genética para el gusano y las cepas bacterianas. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención GM089795 a CPH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Día Worm Prep Material Prep | |||
| -7 O antes | Mantener limpio y bien alimentados Clr-1 (e1745) N2 y gusanos | Hacer almohadillas de inyección, placas de NGM, NGM + Carb / placas de IPTG, OP50 acciones LB | |
| -6 | Streak por RNAi comida en LB + Carb | ||
| -5 | Inocular 3 ml durante la noche con comida RNAi | ||
| -4 | Mover embriones para RNAi placa | Semilla RNAi placa | |
| -3 | |||
| -2 | |||
| -1 | |||
| 0 | Cambie los gusanos a 25 durante 4 horas | Hacer las placas de ensayo | |
| Mover gusanos para limpiar las placas de NGM | |||
| Vampírico transferencia | |||
| Recuperar destinatario | |||
| +1 | Eliminar destinatario de la transferencia | ||
| +2 | Resultado Progenie |
Tabla 1. Timeline preparación de materiales.
| Equipos Empresa Número de catálogo | ||
|---|---|---|
| Presión del inyector picolitros | Warner Instruments | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming / Brown micropipeta Puller | Sutter Instruments | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reactivos | ||
| Aceite Mineral | EM Science | MX1560-1 |
| 22x50 n º 1 ½ cubierta de cristal | Corning | |
| SeaKem LE agarosa | Lonza | 50004 |
| Vidrio borosilicato capilares | Mundo Precisiones Instrumentos | 1B100F-4 |
| Solución de hipoclorito de sodio (5% de cloro disponible) | JT Baker | 9416-01 |
| C. elegans Y Cepas bacterianas | ||
| Clr-1 (e1745) II 9 | El Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) | CB3241 |
| GLP-1 RNAi vector 10 | Fuente Bioscience (Biblioteca Ahringer Alimentación) | F02A9.6 |
| Pal-1 RNAi vector 11 | PHC187 | |
| OP50-GFP 5 | El Centro de Genética Caenorhabditis (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP |
Tabla 2. Reactivos y equipos específicos.
Referencias
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 con....
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