Artículo de método

Transferencia de genes a la oreja del ratón en desarrollo por el interior En Vivo La electroporación

DOI:

10.3791/3653

⸱

30 de junio de 2012

 ,  , 
1Oregon Hearing Research Center, Oregon Health & Science University

En este artículo

Resumen

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La oreja de ratón interno es un órgano sensorial placoda derivada del desarrollo cuyo programa se elaboró ​​durante la gestación. Se define un En el útero transferencia de la técnica que consiste en tres pasos: laparotomía ventral del ratón, la microinyección transuterine, y En vivo Electroporación. Utilizamos microscopía de vídeo digital para demostrar los críticos técnicas embriológicas experimentales.

Resumen

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El oído interno tiene 6 epitelios de mamíferos distintos sentidos: 3 crestas de las ampollas de los canales semicirculares, máculas en el utrículo y el sáculo y el órgano de Corti en la cóclea en espiral. El crestas y máculas contienen células ciliadas vestibulares que transduce estímulos mecánicos para servir al especial sentido del equilibrio, mientras que las células auditivas ciliadas en el órgano de Corti son los transductores primarios para escuchar 1. Especificación del destino celular en estos epitelios sensoriales y la morfogénesis de los canales semicirculares y la cóclea llevará a cabo durante la segunda semana de gestación en el ratón y son en gran parte completada antes del nacimiento de 2,3. Estudios sobre el desarrollo del oído interno del ratón se realizan rutinariamente por la recolección de embriones transgénicos en diferentes etapas embrionarias o postnatal para comprender mejor la base molecular de la telefonía celular y / o fenotipos morfológicos 4,5. Se postula que la transferencia de genes a la oreja de ratón en desarrollo interno en el útero </ Em> en el contexto de la ganancia y la pérdida de la función de los estudios representa un enfoque complementario a la transgénesis de ratón tradicional para el interrogatorio de los mecanismos genéticos que subyacen al desarrollo de mamíferos oído interno 6.

El paradigma experimental para llevar a cabo los estudios de genes misexpression en el oído interno del ratón en desarrollo ha demostrado aquí se resuelve en tres pasos generales: 1) laparotomía ventral, 2) la microinyección transuterine, y 3) electroporación in vivo. Laparotomía ventral es una técnica de supervivencia de los ratones quirúrgica que permite la exteriorización del útero para tener acceso experimental a los embriones implantados 7. Microinyección Transuterine es el uso de biselados micropipetas capilares de vidrio, para introducir el plásmido de expresión en el lumen de la vesícula ótica o otocyst. In vivo electroporación es la aplicación de onda cuadrada, impulsos de corriente directa para conducir la expresión del plásmido en las células progenitoras 8-10.

11. Ratón embriológicos técnicas experimentales pueden ser difíciles de aprender de la prosa y las imágenes fijas solamente. En el presente trabajo, demostramos los 3 pasos en el procedimiento de transferencia de genes. La mayoría de la crítica, hacemos uso de la microscopía de vídeo digital para mostrar con precisión cómo: 1) identificar la orientación del embrión en el útero, 2) reorientar los embriones para la orientación inyecciones a la otocyst, 3) microinyectar ADN se mezcla con solución de tinte trazador en el otocyst en los días de embriones 11.5 y 12.5, 4) electroporar la otocyst inyecta, y 5) los embriones de la etiqueta electroporadas para la selección después del parto en el nacimiento. Proporcionamos ejemplos representativos de éxito transfectadas oído interno: una guía ilustrada de las causas más comunes de la mala focalización otocyst, discutir cómo evitar los errores comunes de metodología y las directrices actuales para la redacción de una g en el úteroeno animales transferencia de la atención de protocolo.

Protocolo

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1. La laparotomía ventral

  1. Anestesie una presa cuyos embriones se encuentran en el día embrionario 11.5 (E11.5; mediodía del día se detecta un tapón vaginal es el día del desarrollo embrionario 0,5) por inyección intraperitoneal de una solución de pentobarbital sódico anestesia (7,5 l por cada gramo de peso corporal). Solución de trabajo anestésico: 180 l de 50 mg / ml de solución de pentobarbital sódico; 100 l de etanol absoluto; 320 l de 65 mg / ml de sulfato de magnesio acuoso (modula el tono uterino), y 400 l de propilenglicol (miscibles con vehículo acuoso y orgánico componentes).
  2. Evaluar la integridad de la anestesia mediante la realización de las pruebas de estímulos nocivos: apretar la pata, la respuesta y abrir y cerrar de tocar la mejilla y vibrisas; pizca cola. Aplique una pomada oftálmica estéril de las córneas.
  3. Afeitarse la piel abdominal de la zona suprapúbica de la caja torácica con tijeras y una hoja fina (Oster # 40 hojas). Desinfecte el abdomen con etanol al 70%, 10% de yodo povidona (Betadine), unnd 70% de etanol, de forma secuencial. Coloque el abdomen del ratón hacia abajo en un campo estéril, a continuación, establecer una almohadilla térmica o una placa caliente (37 ° C) durante 2-5 minutos.
  4. Incisión en la piel del abdomen en la línea media ventral, con la pelota de punta de las tijeras. Extienda la incisión de 10-14 mm. Identificar la línea alba, una banda de avascular, blanco tejido conectivo a lo largo de la línea media ventral de la pared abdominal. Incisión en la línea alba con la pelota con punta de tijera y extender la incisión 10-14 mm. Inmediatamente irrigar el abdomen con precalentado (37 ° C) solución de Ringer lactato.
  5. Externalizar los dos cuernos del útero con una pinza de anillo, sin ejercer demasiada presión sobre los lugares de implantación. Lavar los cuernos uterinos con externalizados precalentado, solución de Ringer lactato.

2. Microinyección Transuterine

  1. Se fabrica una pared gruesa, pipeta de vidrio de borosilicato capilar de microinyección con las siguientes características: 12-16 μm diámetro exterior y un bisel de 20 grados. En un extractor de Sutter P-97 pipeta con filamento de caja pequeña, utilice el siguiente programa: el calor = prueba de rampa más 3 unidades, la presión = 200; tire = 0; velocidad = 46; tiempo = 100). Con el Sutter BV-10 biselador, utilice el 104C (oro) disco abrasivo para pipetas de gran diámetro. Volver a suspender el plásmido en la expresión g 3-4 / l de fosfato de calcio libre amortiguada (pH 7.2 a 7.4). Añadir verde rápido cristalina del ADN concentrada vórtice, suavemente durante 30 segundos, y girar a 10.000 g durante 10 segundos. La cantidad mínima de verde rápido requerido para rastrear visualmente la eficacia de la inyección se determina empíricamente. Rellene la pipeta biselado con el ADN / solución verde rápido. Conecte la pipeta de microinyección cargado al titular de la pipeta de la presión de inyección (Picospritzer con> 99% de nitrógeno puro como gas de la fuente).
  2. Transiluminar el útero con baja intensidad, luz halógena para visualizar el embrión dentro de su lugar de implantación. Identificar la beating corazón, vesículas cerebrales, yemas de las extremidades, la naciente 4 º ventrículo del cerebro posterior, y los ojos. Riegue el útero cada 2 minutos con precalentado, la solución de Ringer lactato para mantener la hidratación. Aplique una leve presión sobre el útero para reorientar el embrión e identificar los puntos de referencia anatómicos se ha indicado anteriormente.
  3. Orientar el embrión para identificar la vena de la cabeza primaria cuya anterior y posterior del flanco sucursales en el territorio mesenquimales en la que el otocyst reside. El otocyst apropiada no puede ser vista por transiluminación del útero. El otocyst se encuentra a medio camino entre las ramas anterior y posterior de la cabeza de la vena principal que, junto con el tronco principal de la vena, constituyen la forma de los montantes o los postes, en un campo de fútbol americano. El otocyst está a medio camino entre los montantes.
  4. Inserte la pipeta de inyección a través del útero de una trayectoria en línea con la ubicación de la presunta otocyst. Pulso del microinyector una vez después de pasar por el utera visualizar el colorante trazador y la aproximación de la localización de la punta de la pipeta. Avanzar en la pipeta bajo control micrométrico y el pulso de nuevo para evaluar la profundidad. Además avanzar en la pipeta en el mesénquima de la cabeza lateral y el pulso en varias ocasiones. El éxito de la focalización otocyst revelará la forma cónica del conducto endolinfático dorsal y la concha de abanico en forma de concha del vestíbulo. Libere la presión sobre el útero, retire la pipeta del embrión / útero en un solo movimiento, e inmediatamente regar el útero con precalentado, solución de Ringer lactato.

3. Electroporación in vivo

  1. Riegue el útero con una solución de lactato de Ringer. Solución de Ringer lactato recién aplicado es necesario par eléctricamente los electrodos de estilo de paletas en el útero. Humedecer las superficies de los electrodos de tungsteno con el Ringer lactato. Centro de la otocyst inyecta en el camino de los electrodos. Suavemente comprimir el útero con la Autoridad Palestina electroporaciónddles. El cátodo está en contacto con la pared uterina lateral a la otocyst inyectado y el ánodo está en contacto con la pared uterina adyacente a la otocyst no inyectado. Dispare un tren de ondas de pulso cuadrado con el interruptor de pedal en el electroporador. Electroporación parámetros son los siguientes: 5, 50 ms pulsos a 43 voltios por impulso y una demora 950 milisegundos entre impulsos. Lavar inmediatamente el útero después del tren de pulsos se entrega. Anotar la corriente suministrada al tejido: 60-100 mAmps es suficiente para transfectar óticas progenitores epiteliales. Inyectar y electroporar 4-6, embriones E11.5 por la presa.
  2. Realizar una microinyección segundo, independiente de la transuterine acuosa de dextrano fluorescente (Alexa Fluor 488 si el plásmido de expresión codifica una proteína fluorescente de color rojo o Alex Fluor 594 si el plásmido de expresión codifica una proteína fluorescente verde) en el ventrículo del 4 de esos embriones cuyos oídos interno son precisión inyectado y por lo menos 60 mAmps de corriente por pulso era delivered durante electroporación. El dextrano fluorescentes serán detectables en el nacimiento en el cerebro posterior y permitir la selección de las crías cuyos oídos internos fueron manipulados durante la embriogénesis (ver 3.5).
  3. Lavar los cuernos uterinos con solución de Ringer lactato. Vuelva a insertar los cuernos uterinos en la cavidad abdominal. Enjuague la cavidad uterina con 2-4 ml de precalentado, solución de Ringer lactato y permitir que el desbordamiento de drenaje de la zona de la incisión en el campo estéril. Vuelva a colocar el drapeado con el material seco y estéril. Suturar la pared abdominal con una aguja no cortante y una sutura reabsorbible 6-0. Nosotros preferimos una puntada corriente, el bloqueo de cada puntada otro, tanto para la pared abdominal y la piel.
  4. Seque la piel de las presas y administrar un fármaco no esteroide anti-inflamatorio, como meloxicam por vía subcutánea. Regreso de la presa a la jaula de recuperación precalentado en un campo estéril. Controlar y registrar las respiraciones de las presas, la apertura del sitio de la incisión y la vagina de secreción sanguinolenta. El sangrado es ravolver, pero si está presente y sin cesar, la eutanasia a la presa, mientras que ella todavía está bajo anestesia. Tenga en cuenta el tiempo que recupera la conciencia y los intentos de caminar. Vuelva a colocar el dique de la colonia de ratones cuando muestra signos de comer y beber y ha empezado a construir nidos. Típicamente, esto se produce dentro de las 12 horas.
  5. Al momento de nacer (después del día 0), el flash de la región posterior del cerebro de cada cachorro de la camada para detectar la fluorescencia dextrano usando un microscopio de disección stereofluorescence con las buenas prácticas agrarias o Texas filtro rojo establecer, según corresponda. Volver a la presa de lactancia sólo los cachorros que muestran el etiquetado posterior del cerebro.

4. Los resultados representativos

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Figura 1. La electroporación mediada por la transferencia de genes para el desarrollo de la cóclea. El otocyst E11.5 fue inyectado con un plásmido que codifica la expresión de una mayor proteína verde fluorescente (EGFP) y electroporated (pulso traen los parámetros de: cinco, 43 pulsos voltios a 50 ms / pulso y 950 ms de retardo entre impulsos). A) Un representante del oído interno de un día de vida 6 (P6), cuya cría otocyst se inyectó y electroporated en E11.5 demostrando EGFP expresión de la base a través de la vuelta media de la cóclea. La pared lateral de la cóclea fue retirado de la vuelta media y el ápice solamente. Progenitores E11.5 que dan lugar a la cúspide no fueron transfectadas. B) Todo el montaje inmunoticción de la cóclea (A) con el marcador de células de pelo, 7 bis, la miosina (Myo7a), indica que la expresión de EGFP sigue la trayectoria del órgano de Corti y es grande localizado en la célula de pelo de soporte de epitelio sensorial. C) Un representante del oído interno de un embrión E18.5 cuya otocyst se inyectó y electroporated en E11.5. La proyección de láser confocal demuestra la expresión de EGFP en Myo7a-positivas las células ciliadas sensoriales. D) láser confocal de proyección del epitelio sensorial coclear del órgano de Corti E18.5 indica EGFP expression en las células ciliadas internas (IHC), las células ciliadas externas (OHC), las células del interior de phalangial (IPC), las células de los pilares (pc), y las células de Deiters (DC). La barra de escala en (B) se aplica a (A).

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Discusión

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La transferencia de genes en el oído interno del ratón en desarrollo: La oreja de ratón interno se desarrolla a partir de la placoda ótica durante la primera semana de desarrollo después de la implantación 12,13. Al día embrionario 9.5 (E9.5), la placoda se invagina y se transformó en una vesícula llena de líquido llamado otocyst 2. Otic precursores en la vesícula dar lugar a las células sensoriales y sensorial dentro del oído interno madura, así como las neuronas que inervan las c...

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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Damos las gracias a Humana Press el permiso para publicar la pipeta de microinyección de fabricación de la figura que apareció originalmente en la página 130 de la referencia 11, Larry Dlugas y Wong Steven, OHSU Departamento de Comunicación Educativa, por videografía, Larry Dlugas para el diseño y edición de vídeo, Adam M. S Quinn, el diseñador senior, Trion / Envirco para el diseño de nuestra costumbre campana de flujo laminar horizontal, y el orfebre de Les para proporcionar el esquema técnico, Víctor Monterroso, MV, MS, PhD y Chatkupt Tom, DVM, OHSU Departamento de Medicina Comparada, de orientación con nuestro animales protocolo de atención, las técnicas quirúrgicas, y profilácticos régimen de analgesia; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, por compartir su folleto sobre técnicas de sutura veterinarios; Edward Porsov, MS, para el diseño de nuestra Adobe Premiere Pro microscopio de vídeo monitor y la computadora, y Blanca Lía y Jonas Hinckley de la LNS subtítulos (Portland, Oregón). Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de la Sordera y other Trastornos de la Comunicación: 008595 DC R01 y R01 DC 008595-04S2 (JB) y P30 DC005983 (Oregon Audiencia Centro de Investigación Core Grant, Peter Gillespie, investigador principal).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios
Micro Case esterilización Roboz RS-9900a 8X8.5X1.25 pulgadas
Con punta de bola tijera Herramientas de Bellas Ciencia 14109-09
Pinzas de anillo Herramientas de Bellas Ciencia 11106-09 4.8mm OD ID/6mm
Pinza Adson tejido Herramientas de Bellas Ciencia 11027-12
Aguja del conductor Herramientas de Bellas Ciencia 12502-12
Alergia bandeja de Jeringa Becton Dickison 305536
Sutura 6-0 Syneture GL-889 0,7 sutura gastrointestinal métrica
Ringer lactato inyectable USP Baxter 2B2323
Verde rápido Sigma Aldrich F7258
Borosilicato capilar de vidrio Aparato de Harvard 30-0053
Solución de sodio Nembutal Ovation Pharmaceuticals Inc. NDC 67386-501-52
MgSO4.7H2O Fisher Scientific M63-500
Propileno glicol Fisher Scientific P355-1
Etanol Sigma Aldrich E7023-500
El meloxicam Boehringer Ingeheim NADA 141-219
Micropipeta Extractor Sutter Instruments P-97 FB255B filamento de caja, consultar libro de cocina con una pipeta de los instrumentos de Sutter
Microelectrodo Biselador Sutter Instruments BV-10 El disco biselado 104C para pipetas de gran tamaño; consulte el manual del propietario para la teoría de biselado
Micropipeta titular de la Warner Instruments MP-S15T Para una pipeta de 1,5 mm de diámetro exterior y el puerto de presión hembra para tubería de Picospritzer.
Pinzas de estilo de electrodos Protech International Inc. CUY650P5 5 mm de diámetro exterior
De onda cuadrada Electroporador Protech International Inc. CUY21EDIT Pedal recomendado
PICOSPRITZER III Parker Hannifin 051-0500-900 Pedal recomendado
Micromanipulador de control manual Aparato de Harvard 640056
Laminar horizontal banco de flujo limpio Envirco Modificaciones personalizadas en LF 630-10554. Ver información complementaria para el esquema de la campana.
Leica stereofluorescence disección microcope con Lumencor SOLA motor de la luz Bartels y Stout y Lumencor MZ10F con Lumencor SOLA motor de la luz Pedales para enfocar el MZ10F y para activar el motor de la luz se recomienda SOLA
Alexa Fluor 594 Dextrano Invitrogen D22913 Acuosa 10mg/ml,
Alexa Fluor 488 Dextrano Invitrogen D22910 Acuosa 10mg/ml,
Enviro-dri Pastor Especialidad de Papanicolaoures www.ssponline.com

Referencias

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