La oreja de ratón interno es un órgano sensorial placoda derivada del desarrollo cuyo programa se elaboró durante la gestación. Se define un En el útero transferencia de la técnica que consiste en tres pasos: laparotomía ventral del ratón, la microinyección transuterine, y En vivo Electroporación. Utilizamos microscopía de vídeo digital para demostrar los críticos técnicas embriológicas experimentales.
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Artículo de método
Transferencia de genes a la oreja del ratón en desarrollo por el interior
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Resumen
Resumen
El oído interno tiene 6 epitelios de mamíferos distintos sentidos: 3 crestas de las ampollas de los canales semicirculares, máculas en el utrículo y el sáculo y el órgano de Corti en la cóclea en espiral. El crestas y máculas contienen células ciliadas vestibulares que transduce estímulos mecánicos para servir al especial sentido del equilibrio, mientras que las células auditivas ciliadas en el órgano de Corti son los transductores primarios para escuchar 1. Especificación del destino celular en estos epitelios sensoriales y la morfogénesis de los canales semicirculares y la cóclea llevará a cabo durante la segunda semana de gestación en el ratón y son en gran parte completada antes del nacimiento de 2,3. Estudios sobre el desarrollo del oído interno del ratón se realizan rutinariamente por la recolección de embriones transgénicos en diferentes etapas embrionarias o postnatal para comprender mejor la base molecular de la telefonía celular y / o fenotipos morfológicos 4,5. Se postula que la transferencia de genes a la oreja de ratón en desarrollo interno en el útero </ Em> en el contexto de la ganancia y la pérdida de la función de los estudios representa un enfoque complementario a la transgénesis de ratón tradicional para el interrogatorio de los mecanismos genéticos que subyacen al desarrollo de mamíferos oído interno 6.
El paradigma experimental para llevar a cabo los estudios de genes misexpression en el oído interno del ratón en desarrollo ha demostrado aquí se resuelve en tres pasos generales: 1) laparotomía ventral, 2) la microinyección transuterine, y 3) electroporación in vivo. Laparotomía ventral es una técnica de supervivencia de los ratones quirúrgica que permite la exteriorización del útero para tener acceso experimental a los embriones implantados 7. Microinyección Transuterine es el uso de biselados micropipetas capilares de vidrio, para introducir el plásmido de expresión en el lumen de la vesícula ótica o otocyst. In vivo electroporación es la aplicación de onda cuadrada, impulsos de corriente directa para conducir la expresión del plásmido en las células progenitoras 8-10.
11. Ratón embriológicos técnicas experimentales pueden ser difíciles de aprender de la prosa y las imágenes fijas solamente. En el presente trabajo, demostramos los 3 pasos en el procedimiento de transferencia de genes. La mayoría de la crítica, hacemos uso de la microscopía de vídeo digital para mostrar con precisión cómo: 1) identificar la orientación del embrión en el útero, 2) reorientar los embriones para la orientación inyecciones a la otocyst, 3) microinyectar ADN se mezcla con solución de tinte trazador en el otocyst en los días de embriones 11.5 y 12.5, 4) electroporar la otocyst inyecta, y 5) los embriones de la etiqueta electroporadas para la selección después del parto en el nacimiento. Proporcionamos ejemplos representativos de éxito transfectadas oído interno: una guía ilustrada de las causas más comunes de la mala focalización otocyst, discutir cómo evitar los errores comunes de metodología y las directrices actuales para la redacción de una g en el úteroeno animales transferencia de la atención de protocolo.
Protocolo
1. La laparotomía ventral
- Anestesie una presa cuyos embriones se encuentran en el día embrionario 11.5 (E11.5; mediodía del día se detecta un tapón vaginal es el día del desarrollo embrionario 0,5) por inyección intraperitoneal de una solución de pentobarbital sódico anestesia (7,5 l por cada gramo de peso corporal). Solución de trabajo anestésico: 180 l de 50 mg / ml de solución de pentobarbital sódico; 100 l de etanol absoluto; 320 l de 65 mg / ml de sulfato de magnesio acuoso (modula el tono uterino), y 400 l de propilenglicol (miscibles con vehículo acuoso y orgánico componentes).
- Evaluar la integridad de la anestesia mediante la realización ....
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Discusión
La transferencia de genes en el oído interno del ratón en desarrollo: La oreja de ratón interno se desarrolla a partir de la placoda ótica durante la primera semana de desarrollo después de la implantación 12,13. Al día embrionario 9.5 (E9.5), la placoda se invagina y se transformó en una vesícula llena de líquido llamado otocyst 2. Otic precursores en la vesícula dar lugar a las células sensoriales y sensorial dentro del oído interno madura, así como las neuronas que inervan las c.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias a Humana Press el permiso para publicar la pipeta de microinyección de fabricación de la figura que apareció originalmente en la página 130 de la referencia 11, Larry Dlugas y Wong Steven, OHSU Departamento de Comunicación Educativa, por videografía, Larry Dlugas para el diseño y edición de vídeo, Adam M. S Quinn, el diseñador senior, Trion / Envirco para el diseño de nuestra costumbre campana de flujo laminar horizontal, y el orfebre de Les para proporcionar el esquema técnico, Víctor Monterroso, MV, MS, PhD y Chatkupt Tom, DVM, OHSU Departamento de Medicina Comparada, de orientación con nuestro animales protocolo de atención, las técnicas quirúrgi....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Micro Case esterilización | Roboz | RS-9900a | 8X8.5X1.25 pulgadas |
| Con punta de bola tijera | Herramientas de Bellas Ciencia | 14109-09 | |
| Pinzas de anillo | Herramientas de Bellas Ciencia | 11106-09 | 4.8mm OD ID/6mm |
| Pinza Adson tejido | Herramientas de Bellas Ciencia | 11027-12 | |
| Aguja del conductor | Herramientas de Bellas Ciencia | 12502-12 | |
| Alergia bandeja de Jeringa | Becton Dickison | 305536 | |
| Sutura 6-0 | Syneture | GL-889 | 0,7 sutura gastrointestinal métrica |
| Ringer lactato inyectable USP | Baxter | 2B2323 | |
| Verde rápido | Sigma Aldrich | F7258 | |
| Borosilicato capilar de vidrio | Aparato de Harvard | 30-0053 | |
| Solución de sodio Nembutal | Ovation Pharmaceuticals Inc. | NDC 67386-501-52 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Propileno glicol | Fisher Scientific | P355-1 | |
| Etanol | Sigma Aldrich | E7023-500 | |
| El meloxicam | Boehringer Ingeheim | NADA 141-219 | |
| Micropipeta Extractor | Sutter Instruments | P-97 | FB255B filamento de caja, consultar libro de cocina con una pipeta de los instrumentos de Sutter |
| Microelectrodo Biselador | Sutter Instruments | BV-10 | El disco biselado 104C para pipetas de gran tamaño; consulte el manual del propietario para la teoría de biselado |
| Micropipeta titular de la | Warner Instruments | MP-S15T | Para una pipeta de 1,5 mm de diámetro exterior y el puerto de presión hembra para tubería de Picospritzer. |
| Pinzas de estilo de electrodos | Protech International Inc. | CUY650P5 | 5 mm de diámetro exterior |
| De onda cuadrada Electroporador | Protech International Inc. | CUY21EDIT | Pedal recomendado |
| PICOSPRITZER III | Parker Hannifin | 051-0500-900 | Pedal recomendado |
| Micromanipulador de control manual | Aparato de Harvard | 640056 | |
| Laminar horizontal banco de flujo limpio | Envirco | Modificaciones personalizadas en LF 630-10554. Ver información complementaria para el esquema de la campana. | |
| Leica stereofluorescence disección microcope con Lumencor SOLA motor de la luz | Bartels y Stout y Lumencor | MZ10F con Lumencor SOLA motor de la luz | Pedales para enfocar el MZ10F y para activar el motor de la luz se recomienda SOLA |
| Alexa Fluor 594 Dextrano | Invitrogen | D22913 | Acuosa 10mg/ml, |
| Alexa Fluor 488 Dextrano | Invitrogen | D22910 | Acuosa 10mg/ml, |
| Enviro-dri | Pastor Especialidad de Papanicolaoures | www.ssponline.com |
Referencias
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Bok, J., Chang, W., Wu, D. K. Patterning and morphogenesis of the vertebrate inner ear. Int. J. Dev. Biol. 51, 521-533 (2007).
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Reimpresiones y permisos
