El uso de interferón-γ enzimo-inmunoensayo para la Caracterización de Nuevos epítopos de células T del virus del papiloma humano

Resumen

Caracterizar los epítopos de células T de patógenos que causan infecciones localizadas, como el virus del papiloma humano, es un desafío debido al número limitado de células T en circulación. Se describe un método mediante el cual se aislaron y caracterizaron células T raras a partir de un número muy pequeño de células.

Resumen

Se ha desarrollado un protocolo para superar las dificultades de aislamiento y caracterización de linfocitos T raros específicos para patógenos, como el virus del papiloma humano (VPH), que causan infecciones localizadas. Los pasos implicados consisten en identificar la(s) región(es) de las proteínas del VPH que contienen epítopo(s) para linfocitos T a partir de un sujeto, seleccionar los linfocitos T específicos para el péptido basándose en la secreción de interferón-γ (IFN-γ) y cultivar y caracterizar los clones de linfocitos T (Fig. 1). El sujeto 1 era un paciente recientemente diagnosticado con una lesión intraepitelial escamosa de alto grado mediante biopsia y que se sometió a una escisión electroquirúrgica con asa para su tratamiento el mismo día en que se recolectaron los linfocitos T¹. Se identificó una región dentro de las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano tipo 16 (VPH 16) que contenía un epítopo para linfocitos T, utilizando un ensayo ELISPOT (enzima inmunoensayo con detección de placas) para IFN-γ realizado con péptidos sintéticos superpuestos (Fig. 2). Los datos de este ensayo se utilizaron no solo para identificar una región que contenía un epítopo para linfocitos T, sino también para estimar el número de linfocitos T específicos para el epítopo y para aislarlos en función de la secreción de IFN-γ mediante microperlas magnéticas comercialmente disponibles (kit de aislamiento de linfocitos T CD8, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Los linfocitos T seleccionados que secretaban IFN-γ se diluyeron y cultivaron individualmente en presencia de una mezcla de células alimentadoras irradiadas para favorecer el crecimiento de un solo linfocito T por pocillo. Estos clones de linfocitos T se cribaron mediante un ensayo ELISPOT para IFN-γ en presencia de péptidos que cubrían la región identificada y células B linfoide transformadas por el virus de Epstein-Barr autólogas (LCLs, obtenidas como se describe en Walls y Crawford)², con el fin de minimizar el número de células del clon de linfocitos T necesarias. En lugar de utilizar 1 x 10⁵ células por pocillo, cantidad típicamente empleada en ensayos ELISPOT^1,3, se utilizaron 1.000 células del clon de linfocitos T en presencia de 1 x 10⁵ LCLs autólogas, reduciendo drásticamente el número de células del clon de linfocitos T necesarias. Las LCLs autólogas sirvieron no solo para presentar antígenos peptídicos a las células del clon de linfocitos T, sino también para mantener una alta densidad celular en los pocillos, lo que permitió a las células del clon de linfocitos T específicas para el epítopo secretar IFN-γ. Esto asegura el correcto funcionamiento del ensayo ELISPOT para IFN-γ. De manera similar, se utilizaron ensayos ELISPOT para IFN-γ para caracterizar la secuencia aminoacídica mínima y óptima del epítopo para linfocitos T CD8 (VPH 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) y su elemento de restricción de clase I del HLA (B58). También se realizó el ensayo ELISPOT para IFN-γ utilizando LCLs autólogas infectadas con virus vaccinia que expresaban la proteína E6 o E7 del VPH 16. El resultado demostró que el epítopo para linfocitos T E6 fue procesado endógenamente. Se mostró el reconocimiento cruzado del epítopo homólogo de linfocitos T de otros tipos de VPH de alto riesgo. Este método también puede utilizarse para describir epítopos para linfocitos T CD4⁴.

Protocolo

Al realizar un ensayo ELISPOT de IFN-γ con una línea de células T CD8 establecida a partir del Sujeto 1, se determinó que la región 46-70 de E6 del VPH 16 contiene un epítopo de células T¹ (Fig. 2), y las células T específicas para este epítopo se seleccionaron en función de la secreción de IFN-γ antes de iniciar este protocolo (Fig. 1).

1. Dilución limitante de linfocitos T específicos para epítopos

1. Prepare la mezcla de células alimentadoras combinando células mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas (4.000 rad) a 5 x 10⁵ células/ml, líneas celulares linfob....

Discusión

Tradicionalmente, los inmunólogos intentaron caracterizar epítopos de células T novedosos mediante la estimulación in vitro de las células T de interés y la realización de un experimento de dilución límite para aislar los clones de células T específicos del epítopo. Luego, los clones de células T se caracterizaron utilizando un ensayo de liberación de cromo^8,9. Sin embargo, muchos intentos resultaron infructuosos porque las frecuencias de las células T podrían haber sido demasiado bajas para ser aisla.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Kit de aislamiento de células T CD8	Miltenyi Biotec	130-094-156
Fitohemaglutinina	Remel, Thermo Fisher Scientific	R-30852801	2 mg/vial
Medio de Yssel’s	Gemini Bio Products	400-102	1 % de suero humano agrupado
Placa de 96 pocillos con fondo redondo	BD Biosciences	08-772-17
IL-2 humana recombinante	R&D Systems	202-IL-050	50μg
Placa de 24 pocillos	Corning	07-200-84
Solución salina tamponada con fosfato	Cellgro	MT-21-031-CV
Anticuerpo monoclonal primario anti-IFN-γ (D1K)	Mabtech	3420-3-1000
Anticuerpo monoclonal anti-IFN-γ conjugado con biotina (7B-6)	Mabtech	3420-6-1000
Placa Multiscreen HA para ELISPOT	EMD Millipore	MAHA S45 10
Dimetilsulfóxido	Sigma-Aldrich	D2650	Botella de 100 ml
Suero agrupado humano	Atlanta Biologicals	S40510H	Inactivar por calor
RPMI 1640	Cellgro	MT-10-040-CV
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100ml
Kit Vectastain Elite ABC	Vector Laboratories	NC9313719
Diaminobencidina estable	Open Biosystems	MBI 1241
Lector AID EliSpot Reader Classic	Autoimmun Diagnostika GmbH	ELR06