Las proyecciones estereotipadas de aferencias sensoriales en la médula espinal de roedores ofrecen un sistema experimental de fácil acceso para estudiar la ramificación axonal a través del rastreo de los axones individuales.
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Artículo de método
DII-etiquetado de las neuronas DRG para el Estudio de ramificación axonal en una preparación Todo el montaje del cable del ratón embrionario espinal
En este artículo
Resumen
Resumen
Aquí se presenta una técnica para marcar la trayectoria de los pequeños grupos de neuronas DRG en la médula espinal de embriones mediante la tinción difusa con el trazador lipofílico 1,1 '-dioctadecil-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perclorato (DII) 1 . La comparación de las vías axonal de tipo salvaje con los de las líneas de ratón en el que los genes están mutados permite realizar pruebas para un papel funcional de las proteínas candidatas en el control de la ramificación axonal, que es un mecanismo esencial en el cableado del sistema nervioso. Ramificación axonal permite una neurona individual para conectarse con múltiples objetivos, proporcionando así la base física para el procesamiento paralelo de la información. Ramificaciones en las regiones objetivo intermedio de crecimiento axonal puede ser distinguida de arborización terminal. Además, los diferentes modos de formación de ramas axonal puede ser clasificado en función de si los resultados de la ramificación de las actividades del cono de crecimiento (división o un sostén retrasonching) o desde la brotación de las garantías del eje del axón en un proceso llamado intersticial ramificación 2 (Fig. 1).
Las proyecciones centrales de las neuronas de los DRG ofrecer un sistema útil experimental para el estudio de ambos tipos de ramificación axonal: cuando sus axones aferentes llegar a la zona de la raíz dorsal de entrada (DREZ) de la médula espinal entre los días embrionarios 10 a 13 (E10 - E13) que muestran un patrón estereotipado de T o bifurcación en forma de Y. Los dos axones que resulta hija a continuación, proceder en sentido rostral o caudal, respectivamente, en el margen dorsolateral de la médula y sólo después de un período de espera colaterales brotan de estos axones madre para penetrar en la materia gris (intersticiales de ramas) y el proyecto de las neuronas de relevo en determinados láminas de la médula espinal donde se ramifican más (terminal de ramificación) 3. Trazados DII han revelado los conos de crecimiento en la zona de la raíz dorsal de entrada de la médula espinal que parecía estar en el proceso de dividir lo que sugiere que la bifurcación se produce por la división del cono de crecimiento en sí mismo 4 (Fig. 2), sin embargo, otras opciones han sido discutidos y 5.
Este video muestra primero cómo diseccionar la médula espinal de los ratones E12.5 salir de la DRG adjunto. Después de la fijación de las cantidades pequeñas de muestra de DII se aplican a DRG el uso de agujas de cristal sacados de los tubos capilares. Después de una etapa de incubación, la médula espinal etiqueta se monta como un libro abierto invertido preparación para analizar los axones individuales mediante microscopía de fluorescencia.
Protocolo
1. Disección de procedimiento
Nota: El uso experimental de ratones deben seguir las directrices aprobadas oficialmente por el cuidado y uso de animales de laboratorio.
- Antes de preparar, configurar el microscopio de disección y diseñar los instrumentos quirúrgicos necesarios para la disección como tijeras grandes y pequeñas, grandes pinzas dentadas, pinzas curvas y cuatro juegos de Dumont N º 5 Pinzas de disección (dos de los cuales en el interior pulido consejos) ( para más detalles ver la tabla de reactivos y equipos específicos). Coloque una hoja de papel de filtro en una de 100 mm con recubrimiento Sylgard placa de....
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Discusión
Patrones estereotipados de proyección compuesto por dos tipos de formación de ramas axonal, junto con la facilidad de preparación en combinación con el uso de tejido fijado para DII etiquetado hace que la médula espinal de embriones con DRG adjunta un modelo favorable a estudiar la ramificación axonal. La aplicación de pequeñas cantidades de DII el uso de agujas de vidrio recubiertas permite - en contraste con el etiquetado mayor parte de DRG - la visualización de pequeños grupos de neuronas DRG y por lo tanto el anális.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al Dr. Alistair Garratt (Centro Max Delbrück, en Berlín) por sus valiosos comentarios. Este trabajo fue apoyado por el centro de investigación en colaboración (SFB665) del Consejo Alemán de Investigaciones (DFG).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| Estereomicroscopio Stemi República Democrática del Congo | Zeiss | ||
| Solución tampón de fosfato (PBS) | Biochrom AG | L182-50 | |
| Paraformaldehído | Merck | 8.18715.1000 | |
| Estándar de tijeras quirúrgicas | Herramientas de Bellas Ciencia | 14001-13 | |
| Dientes de pinzas estándar | Herramientas de Bellas Ciencia | 11021-14 | |
| Extra fino tijeras iris | Herramientas de Bellas Ciencia | 14088-10 | |
| Pinzas curvas | Herramientas de Bellas Ciencia | 11003-13 | |
| Dumont N º 5 puntas finas pinzas | Herramientas de Bellas Ciencia | 11254-20 | |
| Dumont No.5 acabado de espejo fórceps | Herramientas de Bellas Ciencia | 11252-23 | |
| Vannas-Tübingen primavera tijeras | Herramientas de Bellas Ciencia | 15008-08 | |
| Papel de filtro | Fisher Scientific | FB59041 | |
| Sylgard 184 | Instrumentos del Mundo Precisión | SYLG184 | |
| De 100 mm cajas de Petri | Greiner | 663102 | |
| 12 ml de polipropileno tubo | Carl Roth GmbH | ECO3.1 | |
| De 12 y cultivo en placa | Becton Dickinson | 35-3043 | |
| Etanol | Merck | 1.00983.2500 | |
| Flaming / Brown extractor micropipeta P-97 | Sutter Instrument Co. | ||
| Vidrio de borosilicato capilares | Harvard Apparatus | 30-0066 | |
| DII (1,1 '-dioctadecil-3, 3,3', 3'-tetrametil - indocarbocyanine perclorato) | Sigma-Aldrich | 468495 | |
| Portaobjetos Superfrost Plus | Carl Roth GmbH | H867.1 | |
| Vidrio cubreobjetos | Carl Roth GmbH | 1870.2 |
Referencias
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and diO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends. Neurosci. 12 (9), 333-333 (1989).
- Acebes, A., Ferrus, A. Cellular and molecular features of axon collaterals and dendrites. Trends. Ne....
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Reimpresiones y permisos
