La detección de la translocación de la toxina en el citosol de host de resonancia de plasmones superficiales

Resumen

En este informe, se describe cómo resonancia de plasmones superficiales se utiliza para detectar la entrada de toxinas en el citosol de acogida. Este método altamente sensible puede proporcionar datos cuantitativos sobre la cantidad de toxina citosólica, y puede ser aplicado a una serie de toxinas.

Resumen

Toxinas AB consisten en una subunidad enzimática y una subunidad de unión celular B ^1. Estas toxinas son secretadas en el medio extracelular, sino que actúan sobre los objetivos en el citosol eucariota. Algunas toxinas AB viaje por las compañías de vesículas en la superficie celular en el retículo endoplásmico (RE) antes de entrar en el citosol ^2-4. En la sala de emergencias, el catalizador se disocia una cadena del resto de la toxina y se mueve a través de un canal proteico-llevar a cabo para alcanzar su objetivo citosólico ^5. La translocación, citosólica Una cadena es difícil de detectar porque el tráfico de la toxina a la sala de emergencia es un proceso extremadamente ineficiente: la toxina más interiorizado se dirige a los lisosomas para la degradación, por lo que sólo una pequeña fracción de la superficie con destino toxina alcanza el aparato de Golgi y RE ^{6 -12.}

Para controlar la translocación de la toxina de la sala de emergencias para el citosol de las células en cultivo, se combinó un protocolo de fraccionamiento subcelular con los highly método de detección sensible de resonancia de plasmones superficiales (SPR) ^13-15. La membrana plasmática de las células de toxinas es tratada de forma selectiva permeabilizadas con digitonina, logrando la recolección de una fracción citosólica, que posteriormente se perfunde en un sensor de SPR recubierto con una toxina anti-un anticuerpo de cadena. El sensor recubiertas de anticuerpos puede capturar y detectar pg / mL cantidades de la toxina del citosol. Con este protocolo, es posible seguir la cinética de entrada de la toxina en el citosol y caracterizar los efectos inhibitorios en el caso de desplazamiento. La concentración citosólica de la toxina también puede ser calculada a partir de una curva estándar generada con cantidades conocidas de una cadena de normas que han sido perfundidos sobre el sensor. Nuestro método consiste en un sistema rápido, detección sensible, cuantitativa y que no requiere marcaje radiactivo u otras modificaciones a la toxina de destino.

Protocolo

1. Preparación de digitonina

1. Añadir 500 l de etanol al 100% a un tubo de microcentrífuga y lo coloca en un bloque de calor fijado en 80 ° C durante 10 min.
2. Disolver 2,5 mg de digitonina en 250 l de etanol se calienta para producir una solución de reserva del 1% de digitonina.
3. Para generar una solución de trabajo de 0,04% digitonina, agregar 40 ml de la solución madre digitonina a 960 L de HCN buffer (50 mM Hepes pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl _2, 10 mM de N-ethylmaleimide, y un inhibidor de la proteasa cóctel).

2. Intoxicación celular y permeabilización

Nuestro ensayo de translocación se puede aplicar a una serie de toxinas y líneas celulares. A continuación, ofrecemos un protocolo detallado para la detección de la toxina del cólera (CT). Una visión general del procedimiento está previsto en la Figura 1.

1. Las células HeLa se siembran en placas de 6 pocillos con 1 ml de DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino y antibióticos antimicóticos-para lograr 1x10 ⁶ células / pocillo después de una noche de incubación a 37 ° C. Para generar la toxina suficiente citosólica para la detección reproducible, tres pozos son necesarios para cada condición.
2. Después de una incubación durante la noche, sustituir el medio de cultivo con 1 ml de DMEM que contenía 100 ng / mL de gangliósido GM1. Esto aumenta el número de sitios de unión para la TC, como el receptor GM1 de la TC se intercalan en la membrana plasmática de las células expuestas a una solución de GM1.
3. Después de una incubación de 1 hora a 37 ° C, se elimina el medio GM1 que contienen y se lavan las células dos veces con DMEM. Luego, coloque las células a 4 º C durante 30 minutos en 1 ml de DMEM que contenía 1 mg / ml de CT.
4. Eliminar el medio que contiene la toxina, se lavan las células dos veces con DMEM y se incuban las células en 1 ml de DMEM a 37 ° C para el intervalo de tiempo deseado (s).
5. Al final de cada período de persecución, se lavan las células con PBS e incubar cada pocillo con 250 l de 0,5 mM EDTA en PBS. Deje que las células reposar por 10 min a temperatura ambiente y luego sacarlos de la placa de 6 pocillos por trituración vigorosa con un p1000 Pipetman. Después de un pocillo de células que se ha recogido, que se combinan con la segunda y tercera, luego, de la misma condición. Raspadores de células también puede ser utilizado para recoger las células.
6. Lugar la suspensión de células combinadas de los tres pozos de replicar (750 l volumen total) en un tubo de microcentrífuga sola, y lo hace girar en una microcentrífuga de mesa durante 5 minutos a 5.000 x g. Gránulos de las células de un tamaño más o menos equivalente se debe obtener para todas las condiciones.
7. Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 100 L de la solución 0,04% de trabajo de digitonina. Lugar la suspensión de células en hielo durante 10 min.
8. Giro de las células digitonina permeabilized a 16.000 xg durante 10 minutos en una microcentrífuga de mesa. Transferir el sobrenadante citosol que contiene a un tubo de microcentrífuga nuevo, y retener la fracción orgánulos que contienen pellets.

título "> 3. Preparación de la muestra

1. Citosol que contiene fracciones sobrenadante se diluyen en un tampón de HCN a un volumen final de 1 mL. Volúmenes de muestra de al menos 1 ml son necesarias para asegurar el aire se purga del circuito de muestra de 500 l antes de la inyección.
2. Orgánulos que contienen fracciones de pellet se resuspendió en 1 ml de tampón de HCN contiene un 1% Triton X-100. Además de detergente es necesario liberar la piscina revestida de membrana de la toxina.
3. Normas de la toxina en concentraciones de 100, 10, 1 y 0,1 ng / ml se preparan en un tampón de HCN.
4. Paralelos de las fracciones citosólica y orgánulos están preparados para un experimento de control para confirmar la fidelidad de los procedimiento de fraccionamiento. Fracciones generadas como se describe en la Sección 2 se resuspendió en 20 l de tampón de muestra de 4x (fracción citosólica) o 120 l de tampón de muestra 1x (fracción orgánulo). Volúmenes equivalentes de cada fracción se resolvieron por electroforesis en gel de sodio dodecil sulfato de poliacrilamida y probaron by análisis de Western blot para demostrar la partición de una proteína citosólica en el sobrenadante y una proteína soluble, residente de ER en la fracción de pellets ^16-19.

4. SPR preparación de los portaobjetos

1. El refractómetro Reichert SR7000 SPR se usa para los experimentos de SPR.
2. Establecer un portaobjetos de vidrio dorado con una monocapa auto-ensambladas en el instrumento de SPR. Para activar el sensor de diapositivas, perfundir una relación 1:1 (v: v) de 0,4 M y 0,1 EDC NHS M sobre el portaobjetos durante 10 minutos con un caudal de 41 l / min. Todas las perfusiones siguientes utilizarán el mismo caudal.
3. Para quitar la EDC: tampón de activación del SNS, se lava la placa durante 5 min con PBS que contenía 0,05% de Tween 20 (PBST). La placa contiene ahora los amarres reactiva amida debido a destapar por la EDC: solución de NHS.
4. Perfundir un anticuerpo anti-CTA sobre la diapositiva activa el sensor a una dilución de 1:20.000 en acetato de sodio 20 mM (pH 5,5) durante 15 min. Una caída inicial de la refracción endex unidad (RIU) será visto por el cambio de pH. Esto será seguido por un aumento en el RIU, como el anticuerpo es capturado por las cuerdas amida-reactiva en la diapositiva sensor.
5. Eliminar el anticuerpo no unido a partir de la diapositiva del sensor con un lavado PBST 5 minutos. La señal producida por el RIU anticuerpos capturados se estabilizará y estabilizar, que proporciona una señal nueva línea de base.
6. Perfundir 1 M etanolamina (pH 8,5) sobre el portaobjetos sensor de 5 min. Este tapas e inactiva los amarres no unido a la izquierda en la diapositiva sensor.

5. SPR análisis de las muestras

1. Para establecer una lectura de referencia, PBST perfundir sobre el sensor recubiertas de anticuerpos durante 5 min.
2. Perfundir una muestra experimental o estándar de la toxina sobre el sensor de 300 seg. Quitar el ligando del búfer y PBST perfundir sobre el sensor para otro sec 200.
3. Después de cada perfusión, la toxina se elimina obligado desde el sensor de un lavado de 100 segundos con PBST a pH 5,0. Esto devolverá la señalen su lectura inicial de referencia, permitiendo así que otra muestra que se procesa en el mismo sensor.
4. Antes de cargar una nueva muestra, empujar una pequeña cantidad de aire a través del bucle de muestra para expulsar el líquido residual de la muestra anterior. Utilizando el procedimiento descrito en 5.2 a 5.4, hemos llevado a cabo hasta 12 muestras en una diapositiva sin pérdida sustancial de la señal de referencia.
5. El análisis de datos se realiza con el Scrubber 2 software y el software de Igor se utiliza para la preparación de la figura.

6. Resultados representante

La toxina pertussis (PT) es una toxina AB que se mueve de la superficie de la célula a la sala de emergencias antes de que una cadena (PTS1) entra en el citosol ^{3, 12.} Como se muestra en la Figura 2, nuestro SPR-ensayo basado en la translocación podría detectar PTS1 en el citosol de las células CHO intoxicado. No hay señal fue generada desde el citosol de las células unintoxicated, que confirmó el anticuerpo anti-PTS1 no tienen reacción cruzada con un componente de la citosol de acogida. Lafracción citosólica de las células de embriaguez en la presencia de brefeldin A (BFA) también logró producir una señal positiva. BfA impide el transporte de toxinas en el sitio translocación ER ^{06.08, 12, 20-25} y, por tanto, una cadena de suministro para el citosol. Al final de cada carrera, la toxina obligado es despojado de la diapositiva del sensor. Esto permite múltiples muestras que se proyectarán en una diapositiva de un solo sensor y por lo tanto proporciona una comparación directa entre los resultados obtenidos con diferentes condiciones experimentales.

CT es otro tipo AB, ER-translocación de la toxina ^4. En la Figura 3A, CTA1 se detectó en la fracción citosólica de CT tratados con células HeLa. Esto puso de relieve que nuestra metodología funciona con múltiples tipos de células y se puede aplicar a cualquier toxina que un anti-anticuerpo de cadena A está disponible. No se detectó señal cuando la fracción citosólica de la CT-células tratadas fue perfundido en un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTB (Fig. 3B), lo que demuestra que la CTA1subunidad de la célula, pero no vinculante CTB pentámero entra en el citosol. Figura 3C muestra la señal de la fracción orgánulo está fuera de escala en comparación con la señal más débil de la fracción citosólica. Esto fue consistente con la ineficiencia de los CT conocidos de transporte al sitio de translocación ER ^{6, 7,} que a su vez limita la cantidad de toxina que puede alcanzar el citosol. Por otra parte, la fracción organelo contiene holotoxina CT, así como ER-localizada CTA1, por lo que la señal resultante SPR para la fracción orgánulo está inflado por el peso adicional del pentámero holotoxina asociada CTB. Por lo tanto, no es práctico para representar gráficamente los datos de las fracciones citosólica y orgánulos en el sensorgram mismo.

Nuestro ensayo se puede controlar la acumulación en función del tiempo de la toxina trasladadas, citosólica (Fig. 4). Las células fueron expuestas a la TC a 4 ° C, una temperatura que permita unión a la toxina a la membrana plasmática, pero impide la internalización de la toxina asociada a las células. Después de que el removalores de la toxina no consolidados, las células se calentaron a 37 º C. Tanto el transporte de toxinas a la sala de emergencia y un desplazamiento de la cadena hasta el citosol puede ocurrir a esta temperatura. No se detectó la toxina en el citosol de 15 minutos después del calentamiento a 37 º C. Esto refleja el tiempo de espera necesario para el tráfico de holotoxina (i) a la sala de emergencias, (ii) A / disociación subunidad B de la sala de emergencia, y (iii) Una cadena de exportación al citosol. Un grupo de menores de la toxina citosólica se detectó después de 30 minutos a 37 ° C, y las cantidades cada vez mayores de la toxina citosólica se detectaron después de los 45 y 60 minutos de intervalo persecución. Mayores niveles de toxina citosólica se detectaron después de un intervalo de 5 horas ¹⁷ persecución, lo que demuestra un continuo, a largo plazo de entrega de células asociadas a la toxina en el citosol de acogida.

Nuestro análisis también puede detectar la inhibición de la translocación de la toxina en el citosol (Fig. 5). Las células tratadas con 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), un acompañante químico que impide la trast térmicaEring de los aislados CTA1 subunidad (T. Banerjee y Teter K., observaciones no publicadas), mostraron bajos niveles de CTA1 citosólica en comparación con las células control sin tratar. Desarrollo de la toxina de la cadena es un requisito previo para la translocación al citosol ^16-18, por lo que la estabilización de DMSO inducida de CTA1 en consecuencia impide su traslado desde la sala de emergencias en el citosol.

La tasa constante de asociación (k _a) calculado a partir de experimentos de SPR es directamente proporcional a la concentración del ligando en el buffer de la perfusión de ^{14, 15, 26.} Por lo tanto, es posible determinar la concentración citosólica de la toxina de un gráfico que representa los valores de k _una de las normas de la toxina en función de la concentración de toxinas. Este procedimiento se utilizó para cuantificar el bloque de DMSO inducida por la translocación de la toxina se presenta en la Figura 5: la curva estándar generada a partir de concentraciones conocidas de la toxina se utilizó para calcular una citosólica concen CTA1ion de 0,3 ng / ml para las células no tratadas y 0,1 ng / mL de DMSO células tratadas (Fig. 6). La inhibición de la CTA1 desarrollo de DMSO por lo tanto genera una reducción de 3 veces en la translocación de ER-a-citosol de CTA1.

Figura 1. Descripción general del protocolo. (A) Las células se incubaron con la toxina AB a 4 ° C, una temperatura que permita la toxina unión a la superficie celular, pero evita que la endocitosis de toxinas. Las subunidades A y B de la toxina están representados por círculos rojos y azules, respectivamente. (B) Sin consolidar, la toxina se elimina de la media, y las células se calientan a 37 ° C con el fin de promover el transporte retrógrado de la endocitosis y la holotoxina a la sala de emergencias. Holotoxina disociación ocurre en la sala de emergencias, que permite que el aislado una cadena para entrar en el citosol por la que pasa a través de un canal proteico-realización (s) en la membrana del ER. (C) Las células se tratan con digitonina con el fin de permeabilizar selectivamente el plasmamembrana. (D) La centrifugación se utiliza para dividir las células en distintas fracciones citosólica y orgánulos. El citosol es expulsado de la célula a través de los poros digitonina generado y se encuentra en el sobrenadante. El intacta, unidas a la membrana orgánulos se encuentran en la fracción de pellets. (E) Para detectar la piscina trasladadas de la toxina de la cadena en el citosol de acogida, la fracción sobrenadante se perfunde en un sensor de SPR recubierto con un anticuerpo anti-A de la cadena.

Figura 2. Detección de PTS1 translocación en el citosol de acogida. Las células CHO se pulso-marcados a 4 º C durante 30 minutos con 1 mg / ml de PT. Las células fueron perseguidos después de 3 horas a 37 ° C en un medio libre de toxinas que no contiene adiciones (intoxicado) o 5 mg BfA / mL (+ BfA intoxicado). Permeabilización de la membrana plasmática con digitonina se utilizó para los extractos de células partición en distintas organelas y fracti citosólicaComplementos. Un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-PTS1 se utilizó para detectar la piscina citosólica de PTS1 de las células no tratadas o tratadas BfA. PTS1 normas fueron perfundidos en el sensor como controles positivos, mientras que la fracción citosólica de las células unintoxicated fue perfundido sobre la diapositiva sensor como control negativo. Al final de cada ejecución, muestra unida se despojó de la diapositiva del sensor.

Figura 3. Detección de CTA1 translocación en el citosol de acogida. Las células HeLa pulso-marcados a 4 º C con 1 mg / ml de CT fueron perseguidos durante 2 horas a 37 ° C en un medio libre de toxinas que no contiene adiciones (intoxicado) o 5 mg BfA / mL (+ BfA intoxicado). Permeabilización de la membrana plasmática con digitonina se utilizó para los extractos de células partición en distintas organelas y las fracciones citosólica. (A) Las fracciones citosólicas fueron perfundidos por un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTA. Conocidocantidades de CTA se utilizaron como controles positivos, mientras que el citosol de las células unintoxicated se utilizó como control negativo. (B) La fracción citosólica de las células de embriaguez en la ausencia de BfA se perfundió sobre un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTB. A purificada CTB pentámero se perfundió sobre la diapositiva como un control positivo. (C) La fracción orgánulo se solubilizó con 1% de Triton X-100 antes de la perfusión en un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTA. A efectos comparativos, la fracción citosólica (1 ml de volumen final) a partir del extracto misma celda y un estándar de CTA fueron perfundidos también sobre el sensor. Para todos los paneles, la muestra unida se despojó del sensor al final de cada carrera.

Figura 4. Cinética de CTA1 entrada en el citosol. Células HeLa pulso-marcados a 4 º C con 1 mg / ml de CT fueron perseguidos durante 15, 30, 45 o 60 min a 37 ° C en el libre de toxinas medium. Para detectar la piscina trasladadas de la toxina, las fracciones citosólica de digitonina permeabilized células fueron perfundidos por un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTA. Normas CTA fueron perfundidos en el sensor también. Al final de cada ejecución, muestra unida se despojó de la diapositiva del sensor.

Figura 5. La inhibición de la translocación de CTA1 DMSO. Las células HeLa pulso-marcados a 4 º C con 1 mg / ml de CT fueron perseguidos durante 2 horas a 37 ° C en un medio libre de toxinas que no contiene adiciones (intoxicado) o DMSO al 10% (+ DMSO intoxicado). Para detectar la piscina trasladadas de la toxina, las fracciones citosólica de digitonina permeabilized células fueron perfundidos por un sensor de SPR recubiertos con un anticuerpo anti-CTA. Normas CTA (100, 10, 1 y 0,1 ng / ml) fueron perfundidos en el sensor como controles positivos y sólo el 1 y 0,1 ng / mL normas se muestra para fines de escala. El citosol de unintoxicated células se utilizó como control negativo. Al final de cada ejecución, muestra unida se despojó de la diapositiva del sensor.

Figura 6. Cálculo de citosólicas CTA1. K _uno de los valores de los estándares de la CTA en la Figura 5 se representa en función de la concentración de la toxina. La curva resultante estándar se utilizó para determinar, en base a los valores de k _una de las muestras experimentales de la Figura 5, la concentración citosólica de CTA1 en las células sin tratar y tratados con DMSO. Normas de la toxina se presentan como círculos rellenos; el citosol sin tratar se presenta como una plaza abierta, y el citosol tratado con DMSO se presenta como un círculo abierto. Los promedios ± intervalos de dos experimentos independientes se muestran.

Discusión

Comparación con la metodología vigente

Nuestra SPR-ensayo basado en la translocación representa un método rápido, sensible y cuantitativo para detectar la entrega toxina en el citosol de acogida. La técnica no requiere marcaje radiactivo u otras modificaciones a la toxina, y puede ser aplicado a cualquier toxina que un anti-toxina anticuerpo de cadena está disponible. Los métodos existentes para controlar el paso de toxinas en el citosol también se basan en un protocolo de fraccionamiento subc...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Digitonina	Sigma	D141
Etanol	Acros	61509-0010
DMEM	Invitrogen	11995065
El suero fetal bovino	Atlanta Productos Biológicos	S11550
Gangliósido GM1	Sigma	G7641
CTA	Sigma	C2398
PTS1	Lista	182
NHS (N-hidroxisuccinimida)	Atravesar	24500
EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida)	Thermo Scientific	22981
Etanolamina	SiGMA	E0135
PBST	Medicago	09-8903-100
Anti-CTA anticuerpos	Santa Cruz Biotech	sc-80747
Anticuerpos anti-CTB	Calbiochem	227040
Anticuerpos anti-PTS1	Santa Cruz Biotech	sc-57639
Refractómetro	Reichert	SR7000, SR7000DC
SPR sensor de diapositivas	Reichert	13206060
Jeringa de la bomba	Cole Palmer	780200C