Un método rápido y eficiente para integrar ADN ajeno de interés en cepas aceptor pre-hechas, llamadas cepas pista de aterrizaje, se describe. El método permite específica del sitio de integración de un cassette de ADN en el locus de aterrizaje almohadilla de ingeniería de una cepa dada, a través de la conjugación y expresión de la integrasa ΦC31.
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Artículo de método
Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE)
En este artículo
Resumen
Resumen
El cromosoma bacteriano se puede utilizar para mantener establemente ADN extraño en el intervalo de mega-base 1. La integración en el cromosoma elude cuestiones tales como la replicación del plásmido, la estabilidad del plásmido, la incompatibilidad del plásmido, y la varianza plásmido número de copias. Este método usa la integrasa sitio-específico del fago Streptomyces (Φ) C31 2,3. La integrasa ΦC31 cataliza la recombinación directa entre dos sitios de ADN específicas: attB y attP (34 y 39 pb, respectivamente) 4. Esta recombinación es estable y no se volverá 5. Una "pista de aterrizaje" (LP) consiste en la secuencia de un gen de resistencia a la espectinomicina, aadA (SPR), y E. de la coli ß-glucuronidasa gen (uidA) flanqueado por sitios attP se ha integrado en los cromosomas de Sinorhizobium meliloti, anthropi Ochrobactrum y Agrobacterium tumefaciens en una región intergénica, el ampC locus, y el locus tetA, respectivamente. S. meliloti se utiliza en este protocolo. Vectores que contienen sitios donantes movilizable attB flanquean una embutidora rojo proteína fluorescente (RFP) de genes y un gen de resistencia a antibióticos se han construido. En este ejemplo la gentamicina pJH110 plásmido resistente se utiliza. El gen rfp 6 puede ser reemplazado con un constructo deseado utilizando Sph I y Pst I. Alternativamente una construcción sintética flanqueado por sitios attB puede ser sub-clonado en un vector movilizable como pK19mob 7. La expresión del gen de la integrasa ΦC31 (clonado a partir de pHS62 8) es impulsado por el promotor lac, en una amplia gama de huéspedes movilizable plásmido pRK7813 9.
Un protocolo de apareamiento tetraparental se utiliza para transferir el cassette en la cepa donante LP reemplazando así los marcadores en la secuencia de LP con el cassette de donantes. Estas células son trans-integrantes. Trans-integrantes se forman con una eficiencia típica de 0,5%. Trans-integrantes se encuentran típicamente en los primeros 500-1,000 colonias seleccionadas por la sensibilidad a antibióticos o cribado azul-blanco, utilizando 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucurónico (X-gluc). Este protocolo contiene los procedimientos de apareamiento y la selección para la creación y aislando trans integrantes.
Protocolo
1. Producción de la Cultura
- Preparar los medios líquidos estériles: TY 10 (5 g / l de triptona, 3 g / l de extracto de levadura, 0,44 g / l de cloruro de calcio dihidrato), y LB 11 (10 g / l de triptona, 5 g / l de extracto de levadura, 5 g / cloruro de sodio, pH 7).
- Inocular a partir de una sola colonia: SmUW227 (S. meliloti LP-deformación: la construcción se describe en otro lugar, la cepa detalles de la construcción están disponibles bajo petición) () en 5 ml de TY medios de comunicación con 50 mg / ml de espectinomicina. Inocular las siguientes cepas en 5 ml de medio líquido LB, que complementa con el antibiótic....
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Discusión
La técnica IMCE permite la integración eficiente de un cassette de ADN única attB flanqueado en el LP-locus de una cepa previamente diseñado. Una vez que la construcción deseada se clona en lugar de RFP para crear el casete donante, la técnica no requiere la purificación posterior del ADN y la transformación, lo que es muy robusto. Es crítico que los controles apropiados de crecimiento se incluyen, para estar seguro de la resistencia a los antibióticos se debe a la creación de trans-integrantes y no a .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Para Margaret Smith CM por la amabilidad de proporcionar el clon de la integrasa
Apoyo financiero de:
Genome Canada / Genome Prairie
NSERC Discovery y subvenciones de proyectos estratégicos
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Estreptomicina | Bioshop Canada Inc. | STP101 | |
| La espectinomicina | Bioshop Canada Inc. | SPE201 | |
| Gentamicina | Bioshop Canada Inc. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Canada Inc. | CLR201 | |
| La tetraciclina | Bioshop Canada Inc. | TET701 | |
| Kanamicina | Bioshop Canada Inc. | KAN201 | |
| Agar bacteriológico de grado | Bioshop Canada Inc. | AGR001 | |
| Triptona | Bioshop Canada Inc. | TRP402 | |
| Extracto de levadura | Bioshop Canada Inc. | YEX401 | |
| Cloruro de Sodio | Bioshop Canada Inc. | SOD001 | |
| Cloruro de calcio | Bioshop Canada Inc. | CCL444 | |
| X-gluc | Gold Biotechnology Inc. | G1281C1 | |
| E. coli cepa MT616 | Disponible bajo pedido | También se usa fuera de nuestro laboratorio | |
| E. coli cepa pJC2 | En la casa, disponible bajo pedido | ||
| E. coli cepa pJH110 | En la casa, a disposición por request | ||
| SmUW227 cepa | En la casa, disponible bajo pedido |
Referencias
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N.
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Reimpresiones y permisos
