Los ratones transgénicos han sido extremadamente útiles en atribuir la función fisiológica de los genes. Como este tipo de investigación, en general, y los estudios funcionales de las vías respiratorias, en particular, han experimentado un notable cambio hacia modelos murinos. A continuación presentamos los protocolos para In vitro Estudios de la tráquea de constricción para evaluar la función del músculo liso en las vías respiratorias de ratón.
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Artículo de método
Mediciones in vitro de la constricción de la tráquea Utilizando ratones
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Resumen
Resumen
Transgénicos y ratones knock-out han sido herramientas poderosas para la investigación de la fisiología y la fisiopatología de las vías respiratorias 1,2. En tensometry in vitro de aislados traqueal preparativos ha demostrado ser una prueba útil de músculo liso bronquial (ASM) la respuesta contráctil en ratones modificados genéticamente. Estas preparaciones in vitro traqueales son relativamente simples, dar una respuesta contundente, y retener a los dos terminaciones nerviosas colinérgicas funcionales y las respuestas musculares, incluso después de incubaciones largas.
Tensometry traqueal también proporciona un ensayo funcional para estudiar una variedad de vías de segundo mensajero de señalización que afectan a la contracción del músculo liso. La contracción de la tráquea está mediado principalmente por los nervios parasimpáticos, los colinérgicos que la liberación de acetilcolina en ASM (Figura 1). Los principales receptores de acetilcolina son ASM muscarínicos M2 y M3, que son G E / S y los receptores acoplados a Gq, respectivamente 3,6,7. M2 / G i / o señalización se cree que mejora las contracciones por la inhibición de la adenilato ciclasa que conduce a una disminución en los niveles de AMPc 5,8,9,10. Estas vías constituyen el llamado "fármaco-contracción de acoplamiento" de músculo liso bronquial 11. Además, la señalización a través de receptores colinérgicos M2 (y modulada por M3 señalización) implica vías que despolarizan la ASM que a su vez activar tipo L, dependientes de voltaje canales de calcio (Figura 1) y el influjo de calcio (llamado "acoplamiento excitación-contracción" ) 4,7. Revisiones más detalladas sobre las vías de señalización que controlan la constricción vía aérea se puede encontrar 4,12. Las vías superiores parecen ser conservadas entre los ratones y otras especies. Sin embargo, tráqueas de ratón difieren de otras especies in algunas vías de señalización. El más destacado es la falta de respuesta contráctil a la histamina y adenosina 13,14, los moduladores ASM bien conocidas en los seres humanos y otras especies 5,15.
Aquí se presentan los protocolos para el aislamiento de murinos anillos traqueales y la medición in vitro de su producción contráctil. Se incluyen descripciones de la configuración del equipo, el aislamiento de la tráquea y el anillo de las medidas de contracción. Se dan ejemplos para evocar contracciones indirectamente mediante la estimulación de alta de potasio de los nervios y directamente por despolarización del músculo ASM para activar tensión dependiente de la afluencia de calcio (1. Alto K +, Figura 1). Además, los métodos se presentan para estimulaciones de nervios solamente utilizando la estimulación de campo eléctrico (2. SSC, Figura 1) la estimulación, o para directo de músculo ASM utilizando neurotransmisor exógena aplicada al baño (3. Exógeno ACH, Figura 1). Esta flexibility y facilidad de preparación hace que el modelo aislado tráquea anillo un ensayo robusto y funcional para un número de cascadas de señalización que intervienen en la contracción del músculo liso bronquial.
Protocolo
1. Equipo
Los componentes principales de un dispositivo de medición de la contracción se muestra esquemáticamente en la Figura 2A).
- Un baño de tejido. El baño de tejido mantiene una solución fisiológica oxigenada a temperatura caliente. Para ratones anillos traqueales, se utiliza un baño de 10 ml de tejido que contiene una camisa de agua para hacer circular una solución para el calentamiento, una entrada de vidrio poroso a oxígeno burbuja (95% / 5% de O 2 / CO 2 mezcla) y la entrada y salida para cambiar soluciones. Una solución PSS depósito se almacena con burbujeo constante de 95% / 5% de O 2 / CO 2 en una mezcla de 37 ° C baño de agua (no mostrado). Para los intercambios de solución, solución PSS se bombea desde el depósito a la entrada del baño de tejido (puerto inferior) en aproximadamente 100 ml por minuto para permitir el intercambio solución relativamente rápida. La salida solución es a través de un puerto de desbordamiento (puerto superior) que permite que el volumen constante (~ 10 ml) en el tejido murciélagoh durante la solución de intercambio. Utilizamos un circulador de calefacción Haake para bombear agua caliente a través de la camisa de baño de tejido (para mantener 37 ° C). Baños de tejidos puede obtenerse a partir de un número de proveedores y vienen en una variedad de tamaños y estilos para adaptarse a las necesidades experimentales del investigador.
- Un transductor de fuerza. Para medir la tensión isométrica, el tubo de la tráquea se coloca sobre en forma de L extremos de dos varillas de acero inoxidable (Figura 2A). Se debe tener cuidado de utilizar un tipo de acero inoxidable que es compatible con el material biológico. La varilla superior está conectado a través de un clip a un transductor de fuerza isométrica. La varilla inferior contiene la tráquea en una posición fija, y está montado sobre un micrómetro para el ajuste de la tensión pasiva y / o la longitud del músculo. La contracción de la tráquea crea tensión en el transductor de fuerza, que se convierte en una señal de tensión en el preamplificador. La varilla inferior también puede ser configurado para incluir dos placas de platino rectangulares (4 mm de separación) t sombrero de flanco de la tráquea (Figura 2B). Las placas de platino están conectados a un estimulador Grass S88 que permite la entrega de un campo eléctrico a través de la tráquea. Alambres abiertos y soldadura están recubiertos con Sylgard (Sylgard 184 elastómero de silicona, de Dow Corning Corp., Midland, MI), para evitar la lixiviación de los metales en la solución del baño.
- A / D de software de conversión, y la adquisición de equipo. Las señales de los preamplificadores se registran en una MacLab 8 sistema de A / D. Se trata de una versión anterior de la ADInstrument actual de hardware Powerlab. Utilizamos la Tabla de programa (ADInstruments) que permite el registro continuo de la tensión durante todo el experimento. Generación de tensión muscular tráquea es muy lenta, y por lo tanto, nos encontramos con que la adquisición de 100 puntos por segundo es adecuada. La medición de la tensión se calibra utilizando pesos conocidos (hasta 5 gramos) antes de cada experimento. Sistemas similares están disponibles en vendedores de otros (por ejemplo, Biopac, Instrumentos de GW).
- Antes de aislamiento tejido del transductor de fuerza está calibrada con pesos conocidos, y el baño de tejido se llena con PSS normales (ver Tabla I). La entrada de aire se ajusta para obtener un flujo de luz de O 2 / CO 2.
- Las tráqueas de dos meses o los ratones más viejos son óptimas. Los animales más jóvenes pueden ser usados, pero tráqueas obtenidos a partir de estos requieren una mayor habilidad para montar en los cables del transductor de fuerza, debido a su pequeño tamaño. Antes de la disección, los ratones están profundamente sedado con isoflurano. El nivel apropiado de sedación se alcanza cuando un dedo del pie-pellizco con fórceps es incapaz de provocar una respuesta. Los ratones son inmediatamente sacrificados por dislocación cervical Una nota importante:. Hemos observado que Avertin (tribromoetanol), un sedante comúnmente utilizado en los ratones, tiene fuertes efectos relajantes sobre el músculo liso bronquial y por lo tanto no deben ser utilizados para estudios de contracción tráquea.
- La piel (y de la piel) se retira del tórax a la garganta. RIBS se cortan de la base del esternón, lateralmente (en ambos lados) a la parte superior del corazón. El esternón y las costillas luego se tira hacia delante en la garganta para revelar el corazón / pulmones, la tráquea, el timo (ventral) y el esófago (que se adjunta a - y dorsal a la tráquea).
- La tráquea se escinde por corte por debajo de la bifurcación bronquial y por encima de la faringe. La tráquea se coloca en un helado oxigenada (95/5) solución PSS (composición dada en la Tabla I).
- La tráquea se diseca limpia de los tejidos circundantes. Durante la limpieza, la tráquea se llevará a cabo en la faringe o por debajo de la bifurcación. Sin embargo, se debe tener cuidado de no aplicar directamente la pinza a la propia tráquea. Tijeras finas se pueden utilizar para cortar los tejidos circundantes, pero el corte debe hacerse siempre paralela a la tráquea para evitar daños. Esta parte del procedimiento se facilita si la preparación tráquea se fija debajo de la bifurcación y por encima de la faringe en un plato Sylgard recubierto (184 Sylgard siliconaElastómero, Dow Corning Corporation, Midland, MI).
- Después de retirar el tejido circundante, la tráquea se corta por debajo de la faringe y encima de la bifurcación bronquial y suavemente montado sobre los cables de fuerza del transductor.
- La tráquea se coloca sobre dos dientes de metal en forma de L (Figura 2A). Una púa está conectado a un transductor de fuerza-desplazamiento para el registro continuo de la tensión isométrica. Otra clavija está conectada a un micrómetro. El baño de tejido se eleva entonces a fin de que la tráquea se sumerge en PSS. Montaje de la tráquea se debe hacer tan pronto como sea posible para minimizar el tiempo en que la tráquea se llevan a cabo fuera de PSS. Con la práctica, el montaje de la tráquea se puede hacer en un minuto, pero por lo general evitar veces más de 3 minutos para evitar la pérdida de viabilidad.
- El micrómetro se ajusta lentamente para obtener una tensión pasiva de ~ 10 mN (~ 1 gramo-fuerza). La tensión de reposo óptima se determina empíricamente y hemos encontrado que la tensión pasiva de ~ 5 a 10 mN resulta en una respuesta equivalente, a la estimulación máxima de niveles altos de potasio. Esto es consistente con un número de otros estudios que utilizan una tensión pasiva en este rango de 16,17,18. Durante los primeros 5-10 minutos, la tensión tráquea pasiva tiende a disminuir algo (tensión-relajación fenómeno) y el micrómetro se utiliza para ajustar la tensión pasiva a ~ 10 mN durante equilibración. La tráquea se deja equilibrar durante al menos 1 hora antes de desafíos experimentales.
3. La estimulación de potasio de alta
Después del equilibrio, la tráquea es desafiado dos veces con una solución de potasio PSS alta (67 mM de KCl, Tabla I). La contracción generalmente requiere minutos ~ 5-10 para alcanzar el estado estacionario en cuyo momento el baño de tejido se enjuaga varias veces con PSS normales para relajarse completamente la tráquea. La contracción de potasio se repite una segunda vez, y una tercera vez (si es necesario) hasta que las contracciones reproducibles se obtienen.
4. La contracción evocada por la estimulación eléctricaLa tráquea está flanqueada por dos placas rectangulares de platino (electrodos) que permiten la estimulación de campo eléctrico (EFS) para la preparación. La respuesta contráctil a SSC es una función de la frecuencia y voltaje. También se ve afectado por parámetros físicos tales como el área de los electrodos y la distancia entre ellos. Las características de potencia del estimulador también afectan a este tipo de respuestas que a voltajes más altos y los resultados actuales del estimulador puede llegar a su máximo. Las características de cualquier sistema EFI se debe determinar mediante el examen de las respuestas contráctiles del músculo en las diferentes duraciones de estímulo, frecuencias, voltajes y duración del pulso. Para nuestra configuración experimental, hemos encontrado que los electrodos separados por ~ 4 mm, y la amplitud de estimulación de 44 V (0,5 ms pulsos) y 30 Hz son óptimas para lograr reproducibles casi máxima respuestas contráctiles.
5. Contracción Evoked por la estimulación colinérgica
La capacidad de respuesta de la tráquea a exógenamente compuestos aplicados se evalúa ya sea mediante la adición de una dosis única del fármaco de interés o, mediante adiciones múltiples de la droga en una forma dosis acumulativa. Para la tráquea, nuestro laboratorio utilizan habitualmente carbacol para activar los receptores colinérgicos, porque, a diferencia de la acetilcolina, carbacol no es degradada por la acetilcolinesterasa. Un razonable de la dosis-respuesta es de 10 -8 a 10 -5 M carbacol. Montaje de la sesión [carbacol]-contráctil curva de respuesta con una ecuación de Hill-tipo permite una estimación de la CE 50 (mitad de la máxima concentración efectiva) que es una medida de la sensibilidad de la contracción traqueal para el agonista colinérgico 19. Vale la pena señalar que una determinada dosis de carbacol dará una respuesta ligeramente mayor que una dosis única de formar parte de una curva dosis-respuesta acumulativa.
6. Los resultados representativos
Un ejemplo de una respuesta contráctil al potasio alta se muestra en la Figura 3A. La contracción alcanza un máximo en los 10 minutos, pero pueden mostrar un ligero descenso a partir de entonces. Durante lavado precoz de potasio, el músculo puede mostrar un aumento transitorio de la contracción que se debe a un descenso de la temperatura como el pequeño volumen de solución PSS sin calefacción en las líneas de solución transitoriamente perfunde la preparación. Esto puede ser minimizado por tener un volumen muerto mínimo en el tubo que conecta el depósito PSS calentada y baño de tejidos, y también mediante el intercambio de solución relativamente rápida (en general que bombear soluciones a 100 ml / min). Cada preparación tendrá algunas diferencias en la respuesta contráctil, debido a las diferencias en la masa muscular o daños sufridos durante la disección. Figura 3B muestra dos tráqueas de la masa muscular diferente desafiados con niveles altos de potasio y carbacol. A pesar de las contracciones colinérgica-evocados diferentes, ely son similares después de la normalización de la respuesta con una solución de potasio (Figura 3C).
La Figura 4 muestra un ejemplo de un carbacol (colinérgico) contracción evocada utilizando dosis únicas (A) y un incremento acumulativo (B). Las soluciones de carbacol se añaden directamente a la bañera y el gas burbujeado ayuda en la mezcla rápida. Cabe señalar que la adición de una dosis única (es decir, 1 mM, Figura 4A) tiene una respuesta ligeramente mayor que la concentración equivalente durante un acumulativo curva dosis-respuesta (1 mM, Figura 4B). 4C figura muestra un gráfico de fuerza de contracción como una función de las concentraciones de carbacol utilizando datos de la Figura 4B. Efectos de carbacol saturan a 10 M de concentración -5. Aunque los agonistas colinérgicos inicia la contracción a través de mecanismos de liberación de calcio, un componente sustancial de la contracción también está mediada por la despolarización yactivación de los canales de calcio dependientes de voltaje 20.
Figura 5 muestra un ejemplo de EFS-evocó las contracciones. Las tráqueas son estimulados con 0,5 milisegundos de duración, 40 voltios pulsos hasta que las contracciones alcanzan una meseta (ver recuadro A1). Un aumento en la frecuencia de estimulación provoca un aumento de la respuesta contráctil (frecuencia curva de respuesta se representa en la Figura 5B). Estimulación de campo eléctrico se ha demostrado que evocan contracciones predominantemente mediante la activación de los nervios presinápticos. Prueba de ello es el efecto de la toxina botulínica, un bloqueador de la liberación del neurotransmisor que bloquea la mayoría de las contracciones provocadas por EFS de la tráquea 21. Por otra parte, la tetrodotoxina, un agente que bloquea los canales de Na + también inhibe la actividad de los nervios y elimina la respuesta de la tráquea a la EFS.
Figura 1. Diagrama de tque las principales vías de señalización en una preparación de la tráquea aislada. Se muestra un terminal de axón colinérgico inervan una célula traqueal músculo liso. Las principales vías de señalización son M3 y M2-muscarínico activación del receptor de acetilcolina (mAChR) que causan la liberación de calcio a través de receptores IP3 (M3) y la reducción de cAMP (M2). Los receptores M2 (y alguna contribución de los receptores M3) también pueden causar la despolarización colinérgico-evocó que activa los canales de tipo L de calcio dependientes de voltaje y el influjo de calcio. Comunes agentes contráctiles y sus efectores son 1. ricos en potasio (despolarizan la célula del músculo liso y axón colinérgico), 2. la estimulación de campo eléctrico (EFS, despolariza colinérgica axón) y 3. aplicación exógena de agentes colinérgicos tales como la acetilcolina o carbacol (activa los receptores muscarínicos directamente).
Figura 2. Diagrama del equipo utilizado para medir las contracciones traqueales. A. El transductor de fuerza, micrómetros y baño de tejido están montados en barras de apoyo por medio de abrazaderas de tornillo. El anillo traqueal se coloca sobre las barras superior e inferior. En el diagrama, el baño de tejido se coloca debajo de la preparación (es decir, durante el montaje de la tráquea sobre el transductor de fuerza). Durante los estudios de contracción, el baño de tejido se mueve verticalmente para bañar la preparación. B. Para la estimulación campo eléctrico de la barra inferior se modifica para incluir dos placas de platino que están montados lateralmente al alambre explotación tráquea. Las placas de platino están conectados por cables eléctricos a un estimulador.
Figura 3. Ejemplos de potasio (67 mm) de respuesta contráctil de la tráquea. (A) muestra respuestas duplicadas y reproducibles a niveles altos de potasio. (B) Ejemplos de respuesta contráctil a carbachol de dos tráqueas diferentes. (C) Las respuestas a las tráqueas en B son similares cuando se normalizand para la respuesta de potasio alto.
Figura 4. Ejemplos de carbacol contracciones inducidas. (A) carbachol contracciones inducidas con dosis únicas seguido de lavado. (B) Ejemplo acumulativo curva dosis-respuesta para la tráquea en A. (C) contracciones pico de B se representan como una función de la concentración de carbacol.
Figura 5. Ejemplos de las contracciones provocadas por la estimulación de campo eléctrico. (A) la estimulación de campo eléctrico de la tráquea gracias a la contracción de 0,5 ms de pulso, 40 voltios, y varias frecuencias de estimulación, como se indica. El recuadro es el tiempo de contracción-expansión a 30 Hz. (B) las contracciones máximas de A son plotted como una función de la frecuencia de estimulación.
PSS normales
| Sal | Conc. (MM) | Cantidad (g / 2 L) |
| NaCl | 119 | 13,91 |
| KCl | 4.7 | 0.7 |
| KH 2 PO 4 | 1,18 | 0,32 |
| MgSO 4 x 7H 2 O | 1,17 | 0,58 |
| NaHCO $ 3 | 18 | 3,02 |
| EDTA | 0,026 | 0,1 ml de 0,5 M |
| Glucosa | 11 | 3,96 |
| Sacarosa | 12,5 | 8,56 |
| CaCl 2 | 2 | 400 ml de 10 mM |
High K + PSS (NACL y ajustes KCl)
| Sal | Conc. (MM) | Cantidad (g / 2 L) |
| NaCl | 56,7 | 6,628 |
| KCl | 67 | 9,991 |
. Tabla 1 Receta para soluciones PSS. Nota: Las soluciones son frescas por semana, con agua ultrapura de calidad y se almacenan en un refrigerador por no más de 5 días para evitar la contaminación de crecimiento.
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Discusión
El protocolo que aquí se presenta ofrece una preparación fisiológica para evaluar la función muscular vías respiratorias. Por lo general, operan 3-4 preparaciones para el baño de órganos al mismo tiempo, sin embargo, los sistemas de envasados están disponibles en una serie de proveedores que permiten la medición simultánea de hasta 8 preparaciones (ADInstruments, Instrumentos del Mundo de precisión y aparatos de la Universidad de Harvard). Hemos utilizado una serie de transductores de fuerza y baños de tejidos de ór...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una beca del Centro para la Innovación en Prevención y Tratamiento de enfermedades de las vías de subvención, el NINDS (NS052574), y del Programa de Sandler para la Investigación del Asma.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Convertidor analógico-digital | ADInstruments | PowerLab 4/35 | |
| Carbacol (cloruro de Carbamoylcholine) | Sigma-Aldrich | C4832 | 10 -2 M en agua (alícuotas pueden ser almacenadas a -20 ° C) |
| Gráficos de Software | ADInstrtuments | LabChart | |
| Termostato de circulación | Haake | Mixer Mill MM400 | |
| Transductor de fuerza isométrica | Kent Científico | TRN001 | |
| Estimulador | Tecnologías de la hierba | S88 Squ salida dualEstimulador de pulsos son | |
| Papel higiénico | IPM | 47264 |
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