Mediciones in vitro de la constricción de la tráquea Utilizando ratones

Resumen

Los ratones transgénicos han sido extremadamente útiles en atribuir la función fisiológica de los genes. Como este tipo de investigación, en general, y los estudios funcionales de las vías respiratorias, en particular, han experimentado un notable cambio hacia modelos murinos. A continuación presentamos los protocolos para In vitro Estudios de la tráquea de constricción para evaluar la función del músculo liso en las vías respiratorias de ratón.

Resumen

Transgénicos y ratones knock-out han sido herramientas poderosas para la investigación de la fisiología y la fisiopatología de las vías respiratorias ^1,2. En tensometry in vitro de aislados traqueal preparativos ha demostrado ser una prueba útil de músculo liso bronquial (ASM) la respuesta contráctil en ratones modificados genéticamente. Estas preparaciones in vitro traqueales son relativamente simples, dar una respuesta contundente, y retener a los dos terminaciones nerviosas colinérgicas funcionales y las respuestas musculares, incluso después de incubaciones largas.

Tensometry traqueal también proporciona un ensayo funcional para estudiar una variedad de vías de segundo mensajero de señalización que afectan a la contracción del músculo liso. La contracción de la tráquea está mediado principalmente por los nervios parasimpáticos, los colinérgicos que la liberación de acetilcolina en ASM (Figura 1). Los principales receptores de acetilcolina son ASM muscarínicos M2 y M3, que son G _{E / S} y los receptores acoplados a Gq, respectivamente 3,6,7. M2 / G _{i / o} señalización se cree que mejora las contracciones por la inhibición de la adenilato ciclasa que conduce a una disminución en los niveles de AMPc ^5,8,9,10. Estas vías constituyen el llamado "fármaco-contracción de acoplamiento" de músculo liso bronquial ^11. Además, la señalización a través de receptores colinérgicos M2 (y modulada por M3 señalización) implica vías que despolarizan la ASM que a su vez activar tipo L, dependientes de voltaje canales de calcio (Figura 1) y el influjo de calcio (llamado "acoplamiento excitación-contracción" ) ^4,7. Revisiones más detalladas sobre las vías de señalización que controlan la constricción vía aérea se puede encontrar ^4,12. Las vías superiores parecen ser conservadas entre los ratones y otras especies. Sin embargo, tráqueas de ratón difieren de otras especies in algunas vías de señalización. El más destacado es la falta de respuesta contráctil a la histamina y adenosina ^13,14, los moduladores ASM bien conocidas en los seres humanos y otras especies ^5,15.

Aquí se presentan los protocolos para el aislamiento de murinos anillos traqueales y la medición in vitro de su producción contráctil. Se incluyen descripciones de la configuración del equipo, el aislamiento de la tráquea y el anillo de las medidas de contracción. Se dan ejemplos para evocar contracciones indirectamente mediante la estimulación de alta de potasio de los nervios y directamente por despolarización del músculo ASM para activar tensión dependiente de la afluencia de calcio (1. Alto K ^+, Figura 1). Además, los métodos se presentan para estimulaciones de nervios solamente utilizando la estimulación de campo eléctrico (2. SSC, Figura 1) la estimulación, o para directo de músculo ASM utilizando neurotransmisor exógena aplicada al baño (3. Exógeno ACH, Figura 1). Esta flexibility y facilidad de preparación hace que el modelo aislado tráquea anillo un ensayo robusto y funcional para un número de cascadas de señalización que intervienen en la contracción del músculo liso bronquial.

Protocolo

1. Equipo

Los componentes principales de un dispositivo de medición de la contracción se muestra esquemáticamente en la Figura 2A).

1. Un baño de tejido. El baño de tejido mantiene una solución fisiológica oxigenada a temperatura caliente. Para ratones anillos traqueales, se utiliza un baño de 10 ml de tejido que contiene una camisa de agua para hacer circular una solución para el calentamiento, una entrada de vidrio poroso a oxígeno burbuja (95% / 5% de O ₂ / CO ₂ mezcla) y la entrada y salida para cambiar soluciones. Una solución PSS depósito se almacena con burbujeo consta....

Discusión

El protocolo que aquí se presenta ofrece una preparación fisiológica para evaluar la función muscular vías respiratorias. Por lo general, operan 3-4 preparaciones para el baño de órganos al mismo tiempo, sin embargo, los sistemas de envasados ​​están disponibles en una serie de proveedores que permiten la medición simultánea de hasta 8 preparaciones (ADInstruments, Instrumentos del Mundo de precisión y aparatos de la Universidad de Harvard). Hemos utilizado una serie de transductores de fuerza y ​​baños de tejidos de ór.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Convertidor analógico-digital	ADInstruments	PowerLab 4/35
Carbacol (cloruro de Carbamoylcholine)	Sigma-Aldrich	C4832	10 -2 M en agua (alícuotas pueden ser almacenadas a -20 ° C)
Gráficos de Software	ADInstrtuments	LabChart
Termostato de circulación	Haake	Mixer Mill MM400
Transductor de fuerza isométrica	Kent Científico	TRN001
Estimulador	Tecnologías de la hierba	S88 Squ salida dualEstimulador de pulsos son
Papel higiénico	IPM	47264