Mechanosensory células de pelo son las células receptoras del oído interno. El mejor caracterizado In vitro El sistema modelo de células maduras de pelo de mamífero utiliza cultivos de órganos de utrículos de ratones adultos. Se presenta la disección del utrículo ratón adulto, y demostramos mediada por adenovirus una infección de células de soporte en utrículos cultivadas.
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Artículo de método
La disección de utrículo ratón adulto y mediada por adenovirus infección de reparto de las células
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Resumen
Resumen
La pérdida de audición y trastornos del equilibrio son a menudo causados por la muerte de las células ciliadas mechanosensory, que son las células receptoras del oído interno. Puesto que no hay una línea celular que representa satisfactoriamente células de mamíferos para el cabello, la investigación sobre las células del cabello se basa en cultivos de órganos primarios. El mejor caracterizado en el sistema modelo in vitro de células maduras de pelo de mamífero utiliza cultivos de órganos de utrículos de ratones adultos (Figura 1) 1-6. El utrículo es un órgano vestibular, y las células ciliadas del utrículo son similares en estructura y función de las células ciliadas del órgano de la audición, el órgano de Corti. El ratón adulto preparación utrículo representa un epitelio sensorial madura para el estudio de las señales moleculares que regulan la supervivencia, la homeostasis y la muerte de estas células.
Mamíferos células ciliadas cocleares están terminalmente diferenciados y no se regenera cuando se pierden. En no-Mamvertebrados de Malí, auditiva o vestibular de la muerte de las células ciliadas es seguida por una intensa regeneración que restaura las funciones de la audición y el equilibrio de 7, 8. La regeneración de las células ciliadas está mediada por las células gliales como de apoyo, que hacen contacto con las superficies basolateral de las células ciliadas del epitelio sensorial 9, 10. Las células de apoyo también son importantes mediadores de la supervivencia de las células ciliadas y la muerte 11. Recientemente hemos desarrollado una técnica para la infección de células de soporte en utrículos cultivadas utilizando adenovirus. Utilizando adenovirus tipo 5 (dE1/E3) para entregar un transgén que contiene GFP bajo el control del promotor de CMV, encontramos que el adenovirus específicamente y de manera eficiente infecta células de soporte. Apoyo a la eficiencia de infección de células es de aproximadamente 25-50%, y las células ciliadas no están infectadas (Figura 2). Es importante destacar que nos encontramos con que la infección viral de las células de sostén no da lugar a toxicidad para las células ciliadas o células de apoyo, como el recuento de células en Ad-GFP infutrículos eja son equivalentes a las de las no infectadas utrículos (Figura 3). Así, el adenovirus-mediada por la expresión de genes en células de soporte de utrículos cultivadas proporciona una poderosa herramienta para estudiar las funciones de apoyo a las células como mediadores de la supervivencia de las células ciliadas, la muerte y la regeneración.
Protocolo
1. Utrículo Disección y Cultura
- La eutanasia de un adulto (de 4 semanas de edad o más) del ratón mediante un protocolo aprobado y decapitar.
- Corta el conducto auditivo externo en ambos lados de la cabeza y tire de la piel hacia adelante hacia la nariz. Dividir en dos la cabeza de atrás hacia delante y quitar el cerebro de ambos lados para revelar el laberinto óseo.
- Recortar el cráneo lejos de la cóclea ósea y transferir el laberinto óseo (incluyendo la ampolla) a una campana de cultivo de tejidos equipado con un microscopio de disección (Nota: el trabajo adenovirus se debe realizar en un armario de Clase II de seguridad biológica).
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Discusión
Las células sensoriales del cabello son susceptibles a la muerte causada por una variedad de tensiones, incluyendo el envejecimiento, el trauma del ruido, y la exposición a fármacos ototóxicos, incluyendo los antibióticos aminoglicósidos y el cisplatino agente antineoplásico. En los resultados de los mamíferos de pelo de muerte celular en la pérdida permanente de la audición y / o alteración de equilibrio. En los sistemas de modelos in vitro son instrumentos esenciales para los estudios destinados a de.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la División de Investigación Intramural del Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de Comunicación. El apoyo adicional fue proporcionada por NIDCD 5R01 DC007613.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Reactivo Empresa Número de catálogo | |||
| Medio 199 | Gibco / Invitrogen | 12350 | |
| DMEM/F12 | Gibco / Invitrogen | 11320 | |
| Bella pinza (# 55) | Herramientas de Ciencias Bellas | 11255-20 | |
| Bella pinza (# 5) | Herramientas de Ciencias Bellas | 11252-30 | |
| Pinzas (# 3) | Herramientas de Ciencias Bellas | 11231-30 | |
| Penicilina G | Sigma | P3032 | |
| Suero bovino fetal | Invitrogen | 10082-139 | |
| Nunc mini bandeja de | Fisher | 12-565-68 | |
| Adenovirus-GFP | Vector Biolabs | 1060 * | |
| Cal-Ex descalcificador | Fisher | CS510-1D | |
| Borohidruro sódico | Sigma | 452882 | |
| Anti-miosina 7a (policlonal) | Proteus Biociencias | 25-6790 | |
| Anti-miosina 7a (monoclonal) | Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma | MYO7A 138-1 | |
| Anti-calmodulina | Sigma | C 3545 | |
| Anti-Calbindin | Chemicon | AB1778 | |
| Fluoromount G | Southern Biotechnology Asociados | 0100-01 |
Cuadro 1. Los reactivos y los instrumentos utilizados en la cultura utrículo y la infección por adenovirus.
* Nota: Ad-GFP es proporcionada normalmente por Vector Biolabs a un título de valores de 1x10 10 PFU / ml. Se solicitó una amplificación personalizado con el fin de proporcionar el virus de stock a un título de 1,2 x 10 11 PFU / ml.
Referencias
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. , (2006).
- Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. Cisplatin-induced hair cell death ....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection
Posted by JoVE Editors on 4/17/2012. Citeable Link.
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