El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

Resumen

Un método para analizar la distribución de progenitores hematopoyéticos de médula ósea en citometría de flujo, así como para aislar eficazmente altamente purificadas células madre hematopoyéticas (HSC) se describe. El procedimiento de aislamiento se basa esencialmente en el enriquecimiento magnética de c-kit + células y células de clasificación para purificar las CMH para los estudios celulares y moleculares.

Resumen

La médula ósea es el lugar principal donde las CMH y más maduras las células sanguíneas progenitoras de linaje residen y se diferencian en un organismo adulto. CMH constituyen una población de células minuto de células pluripotentes, capaces de generar todos los linajes de células sanguíneas para un tiempo de vida ^1. La disección molecular de la homeostasis del CMH en la médula ósea tiene implicaciones importantes en la hematopoyesis, oncología y medicina regenerativa. Se describe el protocolo de etiquetado con anticuerpos fluorescentes y el procedimiento de puerta electrónica en citometría de flujo para anotar subconjuntos progenitoras hematopoyéticas y distribución HSCs en ratones individuales (Fig. 1). Además, se describe un método para enriquecer ampliamente progenitores hematopoyéticos, así como a largo plazo (LT) ya corto plazo (ST) la reconstitución de HSCs agrupados de suspensiones de células de médula ósea por enriquecimiento magnética de las células que expresan c-kit. La preparación de células resultante se puede utilizar para ordenar los subconjuntos seleccionados para in vitro een estudios in vivo funcionales (fig. 2).

Tanto los osteoblastos trabeculares ^2,3 y ⁴ endotelio sinusoidal constituyen nichos funcionales de apoyo CMH en la médula ósea. Hay varios mecanismos que en el nicho de los osteoblastos, como un subconjunto de N-cadherina ^{+ 3} osteoblastos y la interacción de la Tie2 tirosina quinasa del receptor se expresa en las CMH con su angiopoyetina-1 ligando ⁵ de acuerdo en la determinación de la quietud CMH. "Hibernación" en la médula ósea es crucial para proteger a las HSCs de replicación y eventual agotamiento en la actividad un ciclo excesivo ^6. Estímulos exógenos que actúan sobre las células del sistema inmune innato como ligandos de los receptores Toll-like ⁷ y el interferón-alfa ⁶ también se puede inducir la proliferación y diferenciación de las CEH en el linaje de los progenitores comprometidos. Recientemente, una población de HSC de ratón latentes dentro de la lin ^- c-Kit ⁺ Sca-1 ⁺ CD150 ⁺ CD48 ^- CD34 ^- la población ha sido descrito ^8. Clasificación de las células CD34 sobre la base de expresión de la suspensión de células hematopoyéticas progenitoras enriquecido como se ha descrito aquí permite el aislamiento de ambos quiescente autorrenovación LT-HSC y ST-CMH ^9. Un procedimiento similar basado en el agotamiento de linaje de células positivas y la clasificación de LT-HSC con CD48 y Flk2 anticuerpos ha sido descrita previamente ^10. En el presente informe se proporciona un protocolo para la caracterización fenotípica y ex vivo de células análisis del ciclo de progenitores hematopoyéticos, que pueden ser útiles para el seguimiento de la hematopoyesis en diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Además, se describe un FACS sorting procedimiento para CMH, que pueden ser utilizados para definir los factores y mecanismos que regulan su auto-renovación, expansión y diferenciación en la biología celular y ensayos de transducción de señales, así como para el trasplante.

Protocolo

1. Preparación de la suspensión de la célula de la médula ósea

1. Practicar la eutanasia con el ratón y colocar al animal en una sartén inoxidable y el etanol de pulverización 70% sobre su abdomen y la espalda. Recoger fémur y la tibia de las patas traseras, y la columna vertebral.
2. Con precisión todos los residuos de los tejidos blandos de la columna vertebral con unas tijeras de punta afilados y de los huesos de las piernas con una gasa. Huesos en tienda a un tubo Falcon de 50 ml con 30 ml de medio RPMI que contenía 10% inactivado por calor suero fetal bovino (FBS), suplementado con 50 mM β-mercaptoetanol, 100 uM MEM no aminoácidos esenciales, 1 mM....

Discusión

El método aquí descrito permite el análisis rápido y preciso de la hematopoyesis en ratones individuales (Figura 1). Este análisis en diversos parámetros experimentales, incluidos los modelos murinos de inflamación, autoinmunidad, inmunodeficiencia, enfermedades degenerativas, trastornos metabólicos y el cáncer, permite abordar el impacto de las condiciones patológicas en la hematopoyesis. La Figura 3 muestra el análisis de la actividad de las células en el ciclo de LKS electrónicamente.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
RPMI 1640	Gibco	42401
MEM AANE 100X	Gibco	11140
Piruvato de sodio	Gibco	11360
Penstrep	Gibco	15070
PBS	Gibco	20012
FBS	Gibco	16000
Filtro de la célula 40 micras	BD Falcon	352340
7-AAD Solución colorante	BD Pharmingen	559925
Lyse / Fix tampón	BD Pharmingen	558049
Perm tampón III	BD Pharmingen	558050
Ki-67	BD Pharmingen	556026
DAPI	Invitrogen	D21490
CD4 (GK1.5)	eBioscience	150041
CD8 (53-6,7)	eBioscience	150081
CD3 (145-2C11)	eBioscience	150031
CD45R (RA3-6B2)	eBioscience	150452
CD19 (6D5)	eBioscience	150193
Gr1 (RB6-8C5)	eBioscience	155931
Tre119 (TER-119)	eBioscience	155921
NK-1.1 (PK136)	eBioscience	455941
c-Kit (2B8)	eBioscience	171171
Sca-1 (D7)	eBioscicia	135981
CD34 (RAM34)	eBioscience	110341
FcγR (2.4G2)	eBioscience	553145
Anti-APC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-090-855
Columnas LS	Miltenyi Biotec	130-042-401