Generering av Inducerade regulatoriska T-celler från primära humana naiva och minne T-celler

Summary

Vi beskriver ett förfarande för att generera reglerande, minnes-och naiva T-celler från en enda human blodgivare. Polariserad tregs kan sedan jämföras med andra undergrupper i olika genetiska och funktionella tillämpningar med genetiska homogenitet, inklusive en dämpning analys också beskrivet här.

Abstract

Utveckling och underhåll av immunsuppressiva CD4 ⁺ regulatoriska T-celler (tregs) bidrar till perifer tolerans som behövs för att stanna kvar i immunologisk homeostas med den stora mängd själv och kommensala antigener i och på människokroppen. Störningar i balansen mellan tregs och inflammatoriska konventionella T-celler kan resultera i immunopatologi eller cancer. Även terapeutisk injektion av tregs har visat sig vara effektiva i musmodeller av kolit ^1, typ I-diabetes ^2, reumatoid artrit och graft versus host disease, ⁴ flera grundläggande skillnader i mänskligt kontra mus treg biologin ⁵ har hittills uteslutet klinisk användning. Bristen på tillräckligt många, renhet, stabilitet och homing specificitet av terapeutisk tregs krävde en dynamisk plattform av mänsklig treg utveckling för att optimera förutsättningarna för deras ex vivo expansion ^6.

Här vi Describe en metod för differentiering av inducerad tregs (iTregs) från en enda human perifert blod donator som kan brytas ned i fyra steg: isolering av perifera mononukleära celler, magnetisk selektion av CD4 ⁺ T-celler, in vitro cellkultur och fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) av T-cell-underuppsättningar. Sedan treg signaturen transkriptionsfaktor forkhead låda P3 (FOXP3) är en aktiveringsinducerat transkriptionsfaktor i människor ⁷ och ingen annan unik markör föreligger en kombinatorisk panel av markörer måste användas för att identifiera T-celler med suppressoraktivitet. Efter sex dagar i odling, kan celler i vårt system avgränsas i naiva T-celler, minnes-T-celler eller iTregs baserat på deras relativa expressionen av CD25 och CD45RA. Som minne och naiva T-celler har olika rapporterade polarisering krav och plasticities ^8, pre-sortering av det ursprungliga T-cell befolkningen i CD45RA ⁺ och CD45RO ⁺ undergrupper kan bE som används för att undersöka dessa skillnader. Överensstämma med andra, vår CD25 ^Hi CD45RA ^- iTregs uttrycker höga nivåer av FOXP3 ^9, GITR och CTLA-4 ¹¹ och låga halter av CD127 ^12. Efter FACS för varje population, kan resulterande cellerna användas i en suppressor-analys som bedömer den relativa förmågan att fördröja spridningen av karboxifluorescein succinimidylester (CFSE)-märkta autologa T-celler.

Protocol

1. Isolering av humana perifera mononukleära blodkroppar (PBMC) från buffy coat

1. Skaffa en enhet av buffy coat från sjukhus eller i närheten blod centrum. Vårt blod center ger oss cirka 40-60 ml buffy coat per enhet erhålls från normala blodgivare.
2. Häll in blod i en autoklaverad 500 ml glasflaska som innehåller steril PBS för att späda buffy coat. Den slutliga volymen av PBS + lättcellskoncentratet bör vara 250 ml.
3. Fylla tio 50 ml koniska rör med vardera 20 ml Lymphoprep-lösning.
4. Försiktigt lägga över den Lymphoprep lösningen med 25 ml av den utspädda buffy coat, försiktigt så att inte störa Lymfoprep lösningen.
5. Snurra rören under 30 minuter vid rumstemperatur, vid 500 x g. Se till att stänga av centrifugen bromssystem, för att inte störa lymfocytfraktionen.
6. Samla upp PBMC vid gränsytan mellan Lymphoprep och plasma-medium skikt med en pipett. Aspirera plasma-mediet avstängd tills ca 1 mlfortfarande täcker den gula hinnan skiktet som innehåller PBMC. Använda en 10 ml pipett för att överföra PBMC till en ny 50 ml-rör.
7. Tvätta celler två gånger med PBS och därefter återsuspendera celler i 50 ml kall RPMI för räkning på en hemocytometer. Typisk återhämtning är 8 x 10 ⁸ - 1 x 10 ⁹ PBMC.

Detta förfarande kan skalas ner för mindre volymer av blod. Utspädning av helblod är 1:1 i PBS.

2. Magnetisk negativ selektion av totalt CD4 ⁺ T-celler, CD4 ⁺ CD45RA ⁺ naiva T-celler eller CD4 ⁺ CD45RO ⁺ minnes-T-celler från PBMCs med EasySep anrikning Kits (Stem Cell Technologies)

Åtgärder för att följa för 1 x 10 ⁸ till 4,25 x 10 ⁸ PBMC.

1. Återsuspendera PBMC till en slutlig koncentration av 5 x 10 ⁷ per ml i PBS innehållande 2% FBS och 1 mM EDTA. Förflytta celler till en färsk 14 ml polypropen rundbottnad röret.
   Isolering av totalt human CD4 ⁺ T-celler genom negativ selektion: tillsätt humana CD4 ⁺ T-cell Anrikning cocktail av antikroppar (50 ^ per ml av PBMC), blanda och inkubera under 10 minuter vid rumstemperatur.
   1. Isolering av humana naiva T-celler genom negativ selektion: tillsätt 50 pl av anti-CD45RO antikropp per ml av PBMC-cell-suspension, blanda och inkubera under 15 minuter vid rumstemperatur. Lägg berikning cocktail som medföljer kitet (50 pl per ml PBMC), blanda och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter.
   2. Isolering av humana celler minnes-T genom negativ selektion: tillsätt mänskligt minne CD4 ⁺ T-cell Anrikning cocktail av antikroppar (50 ^ per ml av PBMC), blanda och inkubera under 10 minuter vid rumstemperatur.
2. Blanda magnetiska partiklar väl lika fördela dem i hela lösningen. Inte virvel nanopartiklar från naiva kit.
3. Lägg de magnetiska partiklarna (100 ^ per ml PBMC för totala CD4 ⁺ och naiva T-celler val 50 pl per ml av PBMC för minne T-cell urval). Blandning genom att försiktigt pipettera 2-3 gånger och inkuberas vid rumstemperatur under 10 minuter för naiva T-cell selektion eller 5 minuter för minnes-eller totala CD4 ⁺ T-cell selection.
4. Tillsätt PBS innehållande 2% FBS och 1 mM EDTA för att bringa volymen upp till 10 ml per rör. Blanda genom att försiktigt pipettera 2-3 gånger innan de placeras oskyddade rör i silver EasySep magnet för 5, 10 eller 2,5 minuter för totala CD4 ⁺ T-celler, naiva och minne undergrupper respektive.
5. Med röret fortfarande är i EasySep magneten, hälla vätska in nya 50 ml rör för att isolera cellerna av intresse.
6. Upprepa steg 2.5 och 2.6 för bättre återhämtning.

3. Cell Culture Förhållanden Framkalla regulatoriska T-celler

1. Dagen innan steg 1 och 2, jacka vävnad plattor kultur genom att späda första anti-CD3 antikropp (OKT3-klon) till en koncentration av 1 pg / ml i steril PBS. För en 6 brunnsplatta tillsätt 2 mL PBS + anti-CD3 per brunn, för en 12 brunnar tillsätts 1 ml eller en platta med 24 brunnar lägga 500 pl per brunn. Hålla den belagda plattan vid 4 ° C fram till användning.
2. Framställ polarisation medium genom att tillsätta 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin och 50 pM β-merkaptoetanol till RPMI-1640 före kompletterat med 2,06 mM GlutaMax-I och 25 mM HEPES-buffert. Därefter tillsättes 2 ng / ml TGF-β och 5 ng / ml IL-2. Här kan man lägga ligander eller hämmare av intresse för medierna. Resuspendera celler från steg 2 vid en koncentration av 2 x 10 ⁶ celler / ml i polarisation mediet.
3. Pre-varma plattor vid 37 ° C och aspirera PBS av anti-CD3-belagda brunnar före tillsats celler. Tillsätt 4 ml per brunn av cellsuspension för en 6-brunnsplatta, 2 ml av celler för en 12 brunnars platta eller 1 ml av cellerna under en 24-brunnsplatta. Fyll tomma brunnar med PBS för att minska avdunstningen avmedier. Inkubera under 3 dagar vid 37 ° C / _5% CO2.
4. På dag 3 efter utstrykning, centrifugera ner plattan i en centrifug under 5 minuter vid 500 x g. Utan att störa T-celler på botten av plattan, ta bort hälften av materialet och byt med färska media. Alternativt, om brunnen blir överfulla med celler (koncentration över 3 x 10 ⁶ / ml), dela upp volymen lika i en annan anti-CD3 plåt och lägg nytt medium tillbaka till ursprunglig volym. Inkubera under två till tre ytterligare dagar vid 37 ° C / _5% CO2.

4. Fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS) av tre populationer av T-celler

1. Framställ FACS tvättbuffert genom tillsats av 0,5% (vikt / volym) bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM EDTA för att steril PBS. Placera buffert vid 4 ° C för att bli kall.
2. Avlägsna celler från cell-kultur såväl och skölj varje brunn med 2 ml PBS för att säkerställa fullständig cellåtervinning. Placera alla celler i 50 ml polypropenrör och centrifugera vid 500 xg under 10minuter vid 4 ° C.
3. Räkna cellerna på en hemocytometer för att bestämma celldensitet.
4. Placera 3-5 x 10 ⁵ celler per rör i fyra separata 5 ml runda rör botten polystyren för ersättning kontroller. Placera kvarvarande celler i 50 ml polypropenrör, inte mer än 35 x 10 ⁶ celler per rör.
5. Centrifugera ner cellerna under 5 minuter vid 4 ° C och aspirera mediet. Resuspendera celler som skall sorteras i 90 | il kall tvättbuffert per 1 x 10 ^6-celler. Återsuspendera i 100 | il kall tvättbuffert till kompensationen kontrollrören.
6. Till cellerna som skall sorteras, kombinera 2 | il av anti-CD25-PE, 3 | il av anti-CD45RA-PE-Cy5 och 1 | il av anti-CD127-APC per 1 x 10 ^6-celler. Tillsätt ingen antikropp mot det första kompenseringsdonet kontrollrör, 2 | il av anti-CD25-PE för att det andra röret, 3 | il av anti-CD45RA ^- PE-Cy5 till det tredje röret och1 il av anti-CD127-APC till den fjärde slangen. Inkubera alla rören på is under 45 minuter i mörker.
7. Aspirera buffert och återsuspendera cellerna i en koncentration av 1 x 10 ^7-celler per ml tvättbuffert. Tillsätt 1,5 | il av DNas II per ml celler före filtrering genom en 40 | iM nylon cellfilter. Förflytta celler till flera 5 ml polypropenrör rundbottnade rör med inte mer än 3,5 ml per rör. Resuspendera celler tryckutjämningskontroll i 300 | il tvättbuffert.
8. Ställ ersättning MoFlo flödescytometern för att minimera kors detektion av PE, APC och PE-Cy5 filter. Ställ grindar för att sortera iTregs (CD25 ^Hi CD127 ^-/LOW CD45RA ^- celler), obehandlade (CD25-CD45RA ⁺⁾ och minne (CD25 ^- CD45RA ^-) T-celler i 5 ml runda rör botten polystyren innehållande 1 ml serum från nyfödd kalv.

5. Suppression Analys

1. Göra suppression analysmedia genom tillsats av 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 5 ng / ml av IL-2 och 2 ng / ml av TGF-β till AIM-V.
2. Dagen för analysen, kan det renas heterologa CD4 ⁺ T-celler från buffy coat, såsom anges i steg 1 och 2. Dessa kommer att vara målceller för undertryckande analysen och inte innehåller CD25 ⁺ celler treg, såsom kan ses i figur 2, dag 0.
3. Label celler med CellTrace kit enligt tillverkarens instruktioner, förutom användningen av endast 1 | il av 5 mM stamlösning per ml celler i stället för 2 | il. Hålla ut från direkt ljus, tillsätt 18 | il av DMSO som lämnas av CellTrace kit för att en flaska med CFSE att en 5 mM förrådslösning. Återsuspendera den erforderliga antalet målceller (till ett maximum av 1 x 10 ⁷⁾ i förvärmd PBS + 0,1% (vikt / volym) BSA till en slutlig koncentration av 1 x 10 ⁶ celler / ml. Tillsätt 1 pl av 5 mM CFSE per ml celler och inkubera i en 37 ° C vattenbad under 5 minutes. Tillsätt 5 volymer klar iskall RPMI med 10% FBS för att släcka färgning och inkubera på is i 5 minuter. Tvätta cellerna två gånger med kallt komplett RPMI och återsuspendera 1 x 10 ⁵ celler per 100 pl media undertryckande analys.
4. Treg undertryckande inspektör pärlorna från en förrådskoncentration av 2 x 10 ^7-pärlor per ml. Pelleten ett antal kulor lika med det totala antalet celler per experiment genom snabb centrifugering i en Eppendorf-rör. Tvätta pärlor gång med RPMI och re-pellet. Efter aspirering av RPMI, återsuspendera pärlorna så att den lämpliga mängden pärlor per brunn är i 8 pl medium undertryckande assay.
5. Till en 96 brunnars rundbottnad vävnadsodlingsplatta, tillsätt CFSE-färgade celler (1 x 10 ⁵ celler / ml), pärlor inspektören och polariserade och sorteras celler (1 x 10 ⁵ celler / ml) i färskt medium undertryckande analysbetingelser till en önskad mål- (CFSE färgad): effektor (sortering)-förhållandet i en slutlig volym av 200 pl. Alla förhållanden är inställda i tripliCates.
6. Förbered den första av två kontroll tillstånd genom att tillsätta 100 ^ celler CFSE färgade, 8 pl inspektör pärlor och 1 x 10 ⁵ av färska och ofärgade celler i 92 pl suppressor analysmedium per brunn. Förbereda den andra kontroll med samma cellulära komponenter som ovan men utan treg inspektör pärlor.
7. Täckplattan i aluminiumfolie och inkubera vid 37 ° C / _5% CO2 under fem dagar.
8. I mörker, samla cellerna från varje brunn genom pipettering och placera det i en 5 ml rundbottnad polystyrenrör. Centrifugera cellerna vid 500 x g under 5 minuter vid 4 ° C, aspirera mediet, och återsuspendera i 300 pl kall FACS tvättbuffert från steg 4. Analysera första 3 x 10 ⁴ CFSE ⁺ händelser från den levande lymfocytgrinden representerar målceller i ett histogram med Cell Quest mjukvara.

6. Representativa resultat

Exempel på flödescytometriska pseudofärger punktdiagram över fem-dagars-koppRSE övervakning iTreg differentiering baserat på den relativa samuttrycket av CD25 med FOXP3 kan CTLA-4 och CD45RA ses i figur 2. Histogrammet i figur 3 visar en lyckad undertryckande analys i vilken sortering iTregs (CD25 ^Hi CD45RA ^- CD127 ^-/LOW celler). Är den enda deluppsättning av en fem-dagars kultur som har förvärvat reglerande / suppressor förmåga Figur 4 visar inducering av tregs från en naiv T-cell poolen (övre fälten) och en minnes-T-cell poolen (bottenpaneler), efter fem dagars odling i standard iTreg mediet. CFSE färgning av första celler, visar att antingen naiva (övre högra panelen) eller minne T-celler (nedre högra panelen) differentierar till iTregs (högsta FOXP3-uttryckande celler) först efter flera omgångar av celldelning.

Figur 1. Schematisk av experimentella förfarandet. PBMC are separeras ur humant perifert blod genom centrifugering före magnetisk negativ selektion av CD4 ⁺ CD25 ^- T-celler. Efter fem till sex dagar i odling, celler genomgår FACS och saminkuberades med heterologa märkta celler CFSE mål-att mäta suppressoraktivitet.

Figur 2 Renade humana primära CD4 ⁺ CD25 ^-. T-celler odlas i iTreg mediet. En alikvot av celler uppsamlas precis efter isolering (dag 0) och vid dag 1, 3 och 5 i cellkultur för att övervaka fortskridandet av CD45RA, FOXP3, CTLA-4 och CD25-markörer. Den iTreg profil motsvarar CD45RA ^-, FOXP3 ^Hej, CTLA-4 ^Hej och CD25 ^Hi (markeras i in-diagrammet fönster).

Figur 3. Renade CD4 ⁺ CFSE labeled celler (1 x 10 ⁵ / brunn) odlades med treg pärlor undertryckande inspektören i närvaro av sorterade naiva, minnes-eller iTreg celler (3 x 10 ⁴ / brunn). Efter fem dagar skördas celler och CFSE profilen av de färgade cellerna analyserades med flödescytometri. Närvaron av iTreg celler upphäver fullständigt proliferationen av CD4 ⁺ T-celler. Nummer indikerar andelen CFSE-märkta celler som har genomgått delning.

Figur 4 Renat humant primärt naiva. (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RA ⁺⁾ och minne (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RO ⁺⁾ T-celler färgas med CFSE och odlades i iTreg mediet. Efter fem dagar cellerna fenotypades och celldelning priser uppskattas. Såsom indikeras i fig 2, motsvarar iTreg delmängd differentieras från båda undergrupperna avCD45RA ^- CD25 ^Hi FOXP3 ^Hi och CTLA-4 ^Hi (de två senare visas ej). Jämförande CFSE färgning profilerna identifiera iTregs (här som de högsta uttrycker FOXP3 T-celler) som de mest proliferativa cellerna under den fem dagar långa kultur.

Discussion

Medan treg överföring har enorm terapeutisk löfte bekämpa i avstötning autoimmunitet transplantat och andra immun-eller inflammatoriskt förmedlade störningar, metoder för deras effektiva genereringen och stabilt upprätthållande har ännu inte utvecklats. Eftersom endast 1-5% av cirkulerande humana T-celler är tregs, övervinner deras kontrollerad expansion och differentiering denna brist som en viktig avskräckande genomförandet av tregs i kliniken. Å andra sidan, som vi lärt oss av TGN1412 rättegången ^13, är det vetenskapligt och etiskt nödvändigt att i grunden förstå de molekylära händelser som orkestrerar humana T-cell öde beslut innan något terapeutiska regimen. Med denna metod för iTreg differentiering, de resulterande populationer av naiva och minnes-,-T-celler och iTregs underlätta genexpression eller funktionella jämförelser mellan populationer av celler som härstammar från en enda human perifert blod donator. I våra händer har sorterade cellerna harjämförs i microarray och QRT-PCR-analyser för att mäta genetiska förändringar i västra blottar att undersöka de viktigaste signalering händelser eller plåster fastspänning funktionellt mäta användningen jonkanal ^14.

Vårt system ger den extra fördelen av förmågan att manipulera centrala aspekter av differentiering processen kring ett centralt ramverk och avläsning. Sålunda kan en försortering PBMC för att förändra den ingående population av celler eller innefatta små molekylinhibitorer och ligander till odlingsmediet. Man kan också transfektera celler för att överuttrycka eller slå ner ett protein av intresse eller införa en reporter konstruktion. Som en ytterligare fördel, kan vi förändra villkoren för kulturen för att maximera andelen genererade iTregs. Sammantaget skisserar denna mänskliga primära T cellkultur en mycket robust experimentell plattform med en fysiologisk relevans betydligt större än vad som i murina system. Viktigt kan det hålla även en direkt terapeutiskt värde. I själva verket, såsom mos-t nuvarande treg-baserade behandlingsmetoder innebär in vitro eller ex vivo utveckling eller manipulation av celler, kan vårt system ses som en viktig kanal på vägen mot införandet av treg cellterapi i standarden på vården. Framtida utbyggnader på detta system kommer skräddarsyr tregs att bli aktiveras vid mötet med specifik in vivo inflammatoriska antigener snarare än den beskrivna polyklonala aktivering.