El método describe el procedimiento mediante el cual el hawaiano calamar bobtail, Euprymna scolopes Y su simbionte bacteriano, Vibrio fischeri, Se elevan por separado y después se introdujo para permitir la colonización específica del órgano de luz calamar por las bacterias. Detección colonización por bacterias luminiscencia-derivado y por recuento directo de las colonias se describen.
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Artículo de método
La colonización de Euprymna scolopes Squid por Vibrio fischeri
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Resumen
Resumen
Bacterias específicas se encuentran en asociación con el tejido animal 1-5. Estas bacterias de acogida las asociaciones (simbiosis) pueden ser perjudiciales (patógeno), no tienen ninguna consecuencia de fitness (comensales), o ser beneficiosa (mutualismo). Si bien se ha prestado mucha atención a las interacciones patógenas, poco se sabe acerca de los procesos que determinan la adquisición reproducible de beneficio / comensal bacterias del medio ambiente. El mutualismo de luz de órganos entre la marina bacteria Gram negativa V. fischeri y el calamar hawaiano bobtail, E. scolopes, representa una interacción muy específico en el que un único equipo (E. scolopes) establece una relación simbiótica con una sola especie bacteriana (V. fischeri) a lo largo de su ciclo de vida 6,7. La bioluminiscencia producida por V. fischeri durante esta interacción proporciona un beneficio anti-depredadores a E. scolopes durante las actividades nocturnas, mientras que 8,9el tejido del huésped, rica en nutrientes proporciona V. fischeri con un nicho protegido 10. En cada generación de acogida, esta relación se resume, por lo que representa un proceso predecible que puede ser evaluado en detalle en las distintas etapas de desarrollo simbiótico. En el laboratorio, el menor calamar escotilla aposymbiotically (uncolonized), y, si se recogen dentro de los primeros 30-60 minutos y se transfiere a simbionte agua libre, no puede ser colonizado excepto por el inóculo experimental 6. Esta interacción proporciona así un sistema modelo útil en la cual evaluar los pasos individuales que conducen a la adquisición específica de un microbio simbiótica desde el entorno de 11,12.
Aquí se describe un método para evaluar el grado de colonización que se produce cuando recién nacidas aposymbiotic E. scolopes están expuestos a (artificial) de agua de mar que contienen V. fischeri. Este ensayo simple describe la inoculación, la infección natural, y la recuperaciónde bacterias simbiontes del órgano de luz naciente de la E. scolopes. Hay que tener cuidado para proporcionar un entorno uniforme para los animales durante el desarrollo simbiótico, especialmente con respecto a la calidad del agua y las señales de luz. Métodos para caracterizar la población simbiótica descritos incluyen (1) la medición de bioluminiscencia por bacterias derivados, y (2) directo de las colonias el recuento de los simbiontes recuperados.
Protocolo
1. Preparación de inóculos bacterianos
- Día 0
Dos días antes de la inoculación de calamar, la placa de las cepas bacterianas pertinentes sobre LBS 13 de agar. - Incubar las bacterias a 25-28 ° C durante la noche.
- Día 1
Inocular 3 ml de medio de LBS en un tubo de cultivo de vidrio con una colonia de cada uno de V. fischeri cepa de infección. Preparar los tubos duplicados como copia de seguridad. - Día 2
(Coordinar medidas bacterianas 1.4-1.6 con los pasos de calamar 3.7-3.10)
1 h antes de la inoculación, las bacterias ....
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Discusión
El ensayo se describe la colonización permite el análisis de un proceso de simbiosis natural en un entorno controlado de laboratorio. Como tal, se puede utilizar para evaluar la colonización por cepas mutantes, por parte de diferentes aislamientos naturales, y bajo regímenes químicas diferentes. Las variaciones en los experimentos descritos se utilizan comúnmente para evaluar diferentes aspectos de la simbiosis. La cinética de colonización puede ser medida mediante el examen de luminiscencia durante las primeras 24 hora.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen el apoyo Mattias Gyllborg instalación calamares y los comentarios sobre este manuscrito, Michael Hadfield y el Laboratorio Marino Kewalo para la asistencia durante la recolección de campo, y los miembros del Laboratorio de Ruby y McFall Ngai-por sus contribuciones a este protocolo. Trabajo en el Laboratorio de Mandel es apoyado por la NSF IOS-0843633.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre de reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Tubos de vidrio Cultura, 16 mm de diámetro | VWR | 47729-580 | |
| Tapas para tubos de cultivo de vidrio | Pescador | NC9807998 | |
| Espectrofotómetro visible para la determinación de OD 600 | Biowave | CO8000 | Cualquier espectrofotómetro capaz de medir DO 600 va a funcionar. Esta unidad puede medir el diámetro exterior 600 de líquido directamente en los tubos de vidrio de cultivo. Algunos de ajuste del cálculo de inóculo puede ser necesario dependiendo del instrumento utilizado. |
| GloMax 20/20 de un solo tubo luminómetro | Promega | E5311 | Equivalente a la Turner Biosystems 20/20n luminómetro. Incluye el soporte del tubo de microcentrífuga. |
| GloMax 20/20 Norma Luz | Promega | E5341 | Para la calibración del luminómetro. |
| Refractómetro de mano | Foster y Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrar antes de cada uso con agua desionizada. Enjuagar después de cada uso con agua desionizada para evitar la acumulación de sal. |
| Instant Ocean (concentrado de agua de mar artificial) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Preparar a 35 ‰ en agua desionizada, utilizando el refractómetro, a continuación, a través de un filtro de 0,2 micras SFCA filtro. |
| Unidad de filtración | Nalgene | 158-0020 | El surfactante libre de acetato de celulosa (SFCA) de la membrana, de 0,2 m. Hemos observado resultados variables, con algunos filtros que contienen surfactantes de PSA. |
| Pipetas de transferencia | Pescador | 13-711 -9 a.m. | Con una tijera o cuchilla de afeitar, cortar la punta limpiamente por encima de la cresta primero para aumentar el diámetro de la punta de la pipeta y evitar apretar las crías de calamar. |
| Tazones de muestra desechables (vasos de plástico) | Cometa | T9S (9 oz.) | Tazones para la inoculación, con diámetro superior de 3 ¼ ", de diámetro menor de 2 ¼", altura de 3 ". Bowls crear un entorno homogéneo, ya que no tienen borde inferior, en la que el calamar puede quedar atrapado en un nicho de bajo oxígeno. El tamaño se ha optimizado de 40 ml de inóculo. Disponible en webstaurantstore.com, # 619PI9. |
| Drosophila Viales | VWR | 89092-720 | De diámetro Vial coincide con la apertura en el PMT luminómetro. |
| Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Los tubos deben adaptarse a la forma de las manos de mortero. |
| El etanol, Prueba 200 | Pescador | BP2818-100 | |
| Pistilos | Kimble Chase / Kontes | 749521-1500 | |
| Cuentas de enchapado, 5 mm de diámetro | Kimble Chase, | 13500 5 | Preparar 5 por tubo y autoclave. |
Referencias
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacte....
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Reimpresiones y permisos
