Een snelle methode om het genoom ervan te wijzigen<em> V. cholerae</em> Beschreven. Deze aanpassingen behoort het schrappen van enkele genen, gen clusters en genomische eilanden en de integratie van de korte sequenties (bijv. promotor elementen of affiniteit-tag sequenties). De methode is gebaseerd op het natuurlijke transformatie en FLP-recombinatie.
Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor manipuleren bacteriële chromosomen 1-3. De meeste van deze protocollen gebaseerd op het inbrengen van conditioneel replicerende plasmiden (bijv. herbergen pir-afhankelijke of temperatuurgevoelige replicons 1,2). Deze plasmiden geïntegreerd in bacteriële chromosomen basis van homologie-gemedieerde recombinatie. Dergelijke insertie mutanten zijn vaak direct gebruikt in experimentele settings. Als alternatief kan selectie voor plasmide excisie gevolgd door het verlies worden uitgevoerd, die voor Gram-negatieve bacteriën berusten vaak op de teller instelbare levansucrase enzym gecodeerd door het sacB gen 4. De excisie kan herstellen vóór het inbrengen genotype of resulteren in een uitwisseling tussen het chromosoom en het plasmide-gecodeerde kopie van het gemodificeerde gen. Een nadeel van deze techniek is dat het tijdrovend. Het plasmide moet eerst worden gekloneerd, het vereist horizontale overdracht V. cholerae (n meeste otably door paring met een E. coli donor stam) of kunstmatige transformatie van de laatste, en de excisie van het plasmide is willekeurig en kan het herstel van de oorspronkelijke genotype of maak de gewenste wijzigingen als er geen positieve selectie wordt uitgeoefend. Hier geven we een werkwijze voor snelle manipulatie van de V. cholerae chromosoom (en) 5 (figuur 1). Deze TransFLP methode is gebaseerd op de recent ontdekte chitine-gemedieerde inductie van natuurlijke deskundigheid op dit organisme 6 en andere representatieve van het geslacht Vibrio zoals V. fischeri 7. Natuurlijke competentie maakt de opname van vrij DNA waaronder PCR-gegenereerde DNA-fragmenten. Eenmaal opgenomen, de DNA recombineert met het chromosoom gezien de aanwezigheid van een minimum van 250-500 bp flankerend homoloog gebied 8. Inclusief een selectiemerker in-tussen deze flankerende gebieden maakt een eenvoudige detectie van veel voorkomende transformanten.
t "> Deze methode kan worden gebruikt voor verschillende genetische manipulatie van V. cholerae en mogelijk ook andere natuurlijk competente bacteriën. We geven drie nieuwe voorbeelden van wat kan worden bereikt door deze methode naast onze eerder gepubliceerde studie in enige gendeleties en de toevoeging van affiniteit-tag sequenties 5. Verschillende optimalisatie stappen met betrekking tot de initiële protocol van chitine-geïnduceerde natuurlijke transformatie 6 zijn opgenomen in dit TransFLP protocol. Hieronder vallen onder andere de vervanging van krab schelp fragmenten door in de handel verkrijgbare chitine vlokken 8, de donatie van PCR afgeleide DNA omzetmaterialen 9 en de toevoeging van FLP-recombinatie doelplaatsen (FRT) 5. FRT er rekening plaatsgerichte excisie van de selectiemerker gemedieerd door de Flp recombinase 10.De TransFLP hierboven beschreven werkwijze en elders 5 veelvuldig gebruikt in ons laboratorium. Het soort genetische manipulaties die haalbaar zijn onder andere: deletie van enkele genen en clusters, deletie van genomische eilanden (bijv. VPI-1), insertie van sequenties stroomopwaarts van een gen van belang (bijvoorbeeld, promotersequenties) en insertie van sequenties aan het einde van een specifiek gen (bijvoorbeeld coderend affinity tags).
Een import v…
The authors have nothing to disclose.
Ik wil Olga de Souza Silva erkennen voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (SNSF) Subsidie 31003A_127029.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Chitin flakes | Sigma | C9213 | Autoclaving required |
OPTIONAL: Micropulser (in case antibiotic cassette should be excised by Flp recombinase encoded on pBR-flp) | Biorad | 165-2100 | Or comparable electroporators |