Aislamiento de oligómeros de PrP soluble e insoluble en el cerebro humano normal

1. Preparación de homogeneizado de cerebro y las fracciones (P2) soluble Detergente-(S2) y Insoluble-

1. Tome 100 mg congelado tejido cerebral humano y añadir 100 l de tampón de lisis (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% de Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% de EDTA, pH 7,4).
2. Homogeneizarla en hielo usando mano de mortero accionado por un motor sin cuerda, que se congele en hielo seco durante 5 min y se homogeneiza de nuevo utilizando mano de mortero impulsado por las manos primero y luego por el motor, y añadir 300 l o 800 l de tampón de lisis (esto es bien 20 % o 10% homogeneizado de cerebro total, respectivamente).
3. Se centrifuga el homogeneizado de 20% o 10% cerebral total a 1.000 xg durante 10 min a 4 ° C para recoger el líquido sobrenadante (S1) utilizando una centrífuga de sobremesa.
4. Ultracentrífuga S1 10% a 35.000 rpm (100.000 xg) en un rotor SW55 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) durante 1 hora a 4 ° C. Transferir los sobrenadantes (S2) que contienen la fracción de detergente soluble en un tubo limpio. Resuspender los pellets que contienen detergente insolublefracción (P2) en 100 l o 200 l del tampón de lisis para hacer 10 - o 5-fold preparación concentrada.
5. Para PK-digestión, incubar la muestra con las mismas cantidades de PK a 50 mg / ml a 37 ° C durante 1 hora para ambas fracciones S2 y P2. Añadir fluoruro de fenilmetilsulfonilo a una concentración final de 5 mM y volúmenes iguales de tampón de muestra SDS (3% de SDS, EDTA 2 mM, 4% β-mercaptoetanol, 10% de glicerol, 50 mM Tris, pH 6,8) para terminar la digestión con PK. Hervir las muestras durante 10 min y enfriarlos a la temperatura ambiente durante 5 min. Ellos están listos para la transferencia Western.

2. Velocidad de sedimentación en gradientes de sacarosa paso

1. Incubar 450 S1 mu l 20% con un volumen igual de 2% sarcosilo en H ₂ O durante 30 min en hielo.
2. Añadir 0,5 ml de cada uno de 60%, 30%, 25%, 20%, 15%, y 10% de sacarosa en un tubo Beckman con una capacidad máxima de 5 ml.
3. Cargar 0,4 ml de S1 en la parte superior de los gradientes 10-60% de sacarosa paso.
4. Centrifugar a 48.000 rpm (200.000 xg, SW55 rotor) durante 1 h, a 4 ° C.
5. Recoger 283 l cada fracción de la parte superior del tubo y obtener 12 fracciones en total.
6. Tomar 20 l de cada fracción a un nuevo tubo Eppendorf, se añaden 20 l tampón de muestra, y se deja hervir durante 10 minutos.
7. Enfriar las muestras durante 4 minutos en la campana, se centrifuga a 1.000 xg durante 1 min y vórtice ellos. Cargar muestras en un gel prefabricado.

3. Cromatografía de Exclusión de Tamaño

1. Use Superdex 200 perlas HR (Pharmacia, Uppsala, Suecia) en una columna de 1 x 30 cm para determinar el estado oligomérico de moléculas de PrP.
2. Siete marcadores de masa molecular (Sigma, St. Louis, MI) incluyendo azul de dextrano (2.000 kDa), la tiroglobulina (669 kDa), apoferritina (443 kDa), β-amilasa (200 kDa), alcohol deshidrogenasa (150 kDa), albúmina ( 66 kDa), y anhidrasa carbónica (29 kDa) se cargan de forma independiente a las concentraciones recomendadas por Sigma en 200 volúmenes de muestra mu l.
3. El volumen de elución de azul dextRAN se utiliza para determinar el volumen de huecos (V ₀ = 8,45 ml) y el volumen total (V _t = 24 ml) es proporcionado por la instrucción de producto. Los volúmenes de elución del pico (V _e) se calculan a partir del cromatograma y las retenciones fraccionarios. K _av, el coeficiente de partición (definir el comportamiento de la muestra), se calcula utilizando la ecuación: K _av = (V _e - V ₀₎ / (V _t - V _0). La curva de calibración se determina por el trazado de la _av K de los estándares de proteína contra la MW registro de la normas ^8.
4. El peso molecular (MW) de las especies de PrP diversos recuperados en diferentes fracciones de FPLC se evalúa de acuerdo con una curva de calibración generada con la filtración en gel de las distintas normas.
5. Inyectar 200 S1 mu l en tampón de lisis que contiene 1% sarcosilo en la columna para cada ejecución.
6. La cromatografía se realiza en un sistema FPLC (GE Healthcare) a un caudal de 0,25 ml / min y la fraccións de 0,25 ml de cada uno se recogió mediante un colector de fracciones (Amersham Biosciences, RediFrac).
7. Incubar 0,125 ml de cada fracción con 0,5 ml de metanol previamente enfriado a -20 º C durante 2 h.
8. Centrifugar las muestras a 13.000 xg durante 30 min a 4 ° C en una microcentrífuga de sobremesa. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 20 l tampón de muestra de SDS como se ha mencionado anteriormente, la ebullición durante 10 min, se enfría a temperatura ambiente, los cargan en un gel prefabricado.

4. Captura de PrP por g5p

1. La molécula g5p (100 mg) (amablemente proporcionados por los Dres. Kneale y Geoff McGeehan John de la Universidad de Portsmouth, Reino Unido) se conjuga con 7 x 10 ⁸ tosilo activado perlas magnéticas mediante la incubación de 100 mg y 350 g5p cuentas G5p l en 1 ml de salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 ° C durante 20 hr. Atraer G5p-cuentas a la pared lateral de los tubos Eppendorf por la fuerza magnética externa y luego eliminar toda la solución. Lavar las perlas con 1 ml de PBS que contenía0,1% de albúmina sérica bovina (BSA) por tres veces.
2. Incubar las perlas g5p conjugados en 1 ml de 0,2 M Tris-HCl, pH 7,4 que contiene 0,1% de BSA a 37 º C durante 5 h para bloquear la unión no específica y luego lavar las perlas con 1 ml de PBS que contenía 0,1% de BSA durante tres veces como se mencionó anteriormente. Retirar la solución y añadir 1 ml de PBS a las perlas. Las perlas g5p preparadas son estables durante al menos 3 meses a 4 ° C.
3. La captura de PrP por g5p se realiza incubando 100 fracciones mu l S1 o P2 con 60 mu l perlas de g5p conjugados (10 g de proteína / 6 X 10 ⁷ bolas) en 1 ml de tampón de unión (3% de Tween-20, NP-3% 40 en PBS, pH 7,5).
4. Después de la incubación con rotación constante durante 3 horas a temperatura ambiente, las perlas que contienen PrP g5p son atraídos a la pared lateral de tubos Eppendorf mediante fuerza magnética externa, permitiendo la fácil eliminación de todas las moléculas no unidas en la solución.
5. Después de tres lavados en tampón de lavado (2% de Tween-20 y 2% de NP-40 en PBS, pH 7.5), Perlas de g5p se recogen y se calentó a 95 º C durante 5 min en el tampón de muestra SDS (3% de SDS, 2 mM EDTA, 10% de glicerol, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8).
6. Después de enfriar las muestras durante 5 min a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron a 1.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Los sobrenadantes están listos para la transferencia Western.

5. Western Blotting

1. Cargar muestras hervidas en tampón de muestra de SDS al 15% en Tris-HCl Criterion prefabricados geles (Bio-Rad) a 150 V durante ~ 80 min.
2. Las proteínas en los geles se transfieren a PVDF durante 2 horas a 70V.
3. Después de bloquear las membranas en 5% de leche en tampón Tris-solución salina que contiene 0,01% de Tween-20 (TBS-T), las membranas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con 3F4 primarias de anticuerpos monoclonales o policlonales (1:40.000), 1E4 (1 : 1.000), anti-N ⁸ (1:6000), o anti-C ⁸ (1:6.000) para sondear la molécula de PrP.
4. Tras la incubación con HRP de oveja conjugado anti-IgG de ratón en1:3000, o de burro anti-IgG de conejo 1:3000 en las bandas de PrP se visualizan en una película Kodak utilizando ECL Plus, de acuerdo con el protocolo del fabricante.

6. Los resultados representativos

En comparación con muestras de ECJ esporádica, una pequeña cantidad de IPRP ^C se detectó en la fracción P2 en los cerebros normales, aunque la mayoría de la PrP ^C se recuperó en la fracción S2 (Figura 1). Como se ha indicado previamente ^8, cuentas IPRP aproximadamente el 5-25% de la PrP total incluyendo de longitud completa y especies N-terminal truncado.

Los análisis utilizando sacarosa paso sedimentación en gradiente reveló que mientras que la mayoría de la PrP ^C a partir de cerebros de CJD no se recuperó en las fracciones 1-3 mejores, pequeñas cantidades de PrP también se detectó en las fracciones 9-11 fondo que normalmente contienen grandes agregados ⁸ (Figura 2).

Una variedad de PrP ^Sc sonó especiesING a partir de monómeros, oligómeros pequeños a grandes agregados se aislaron por filtración en gel en el cerebro con la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (Figura 3A). Sin embargo, una pequeña cantidad de agregados más grandes con mayor peso molecular de 2.000 kDa también se detectó en las fracciones insolubles de cerebros normales (Figura 3C). Además, dímeros y tetrámeros de PrP ^C no se detectaron sólo en las fracciones insolubles, pero también en las fracciones solubles (figura 3B y 3C).

Después del tratamiento PK y PNGasa, la PrP capturado por g5p se detectó con el anticuerpo 1E4 contra PrP97-105 ^8. Tres resistentes a PK-fragmentos de núcleo denominado PrP * ^20, * ¹⁹ PrP, PrP y * ⁷ se detectaron, migrando a ~ 20 kDa, ~ 19 kDa y ~ 7 kDa, respectivamente (Figura 4, panel izquierdo). Sin embargo, no se detectó PrP cuando el anticuerpo 1E4 se pre-incubaron con un péptido sintético que tiene una secuencia de identiCal para el epítopo 1E4 (Figura 4, panel central), lo que indica que las bandas detectadas por 1E4 son fragmentos de PRP. Además, el anticuerpo anti-C reveló dos fragmentos diferentes de PrP que migraban a ~ 18 kDa (PrP * ¹⁸⁾ y ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), además de PrP * ²⁰ (Figura 4, panel derecho).

Figura 1. Detección de IPRP ^C y ^Sc IPRP. Después del tratamiento con PNGasa F a 1/10 del volumen total de reacción a 37 ° C durante 1 hora para eliminar los glicanos de la proteína, de longitud completa o el N-terminal truncado aislado especies de PrP en las fracciones soluble e insoluble (S2 y P2) por ultracentrifugación en muestras de cerebro de control normal (CTL) y la CJD esporádica (sCJD) se detectaron con 3F4 contra PrP106-112 (panel izquierdo), anti-N contra PrP23-40 (panel central), y anti-C contra PrP220-231 (panel derecho). En las muestras de CTL, una pequeña cantidad de PrP se detecta en P2, mientras que una gran cantidad está presente en S2. En contraste, más PrP se detecta en P2 que en S2 en muestras de sCJD.

Figura 2. Sedimentación de PrP en gradientes de sacarosa paso. PrP en las fracciones individuales de 1 a 11 de no-ECJ S1 cerebrales muestras se detectó por Western Blot con 3F4. Aunque la mayoría de PrP ^C se detectó en las fracciones 1-3 mejores, pequeñas cantidades de PrP también se observaron en las fracciones inferiores 9-11. Además, el patrón de bandas de PrP desde la parte superior y la parte inferior es diferente: PrP recuperado en las fracciones superiores tiene una banda superior dominante, mientras que PrP recuperado en las fracciones inferiores tiene una banda dominante inferior. Un PK-tratada PrP ^Sc se cargó como un control en el lado derecho del blot.

Figura 3. Detección de solubles e insolubles PrP ^C oligómeros. ^C PrP soluble e insoluble de cerebros humanos normales fueron separadas por ultracentrifugación y luego se sometió a filtración en gel, respectivamente. Los tamaños moleculares de las fracciones individuales se midieron mediante la ejecución de un grupo de marcadores de masa molecular. (A) PrP ^Sc especie de muestras de cerebro SCJD. Dos poblaciones de especies de PrP fueron detectados: fracciones de filtración en gel desde 49 hasta 65 contienen monómeros y oligómeros pequeños, mientras que las fracciones 27-33 contienen grandes agregados. Las especies de PrP ^C de la fracción soluble (S2) (B) y la fracción insoluble (P2) (C) de los controles normales fueron detectados. PrP se sondeó con el anticuerpo 3F4. Dímeros (fracción 55) y tetrámeros (fracción 51) de PrP se detectaron no sólo en P2, sino también en S2 de sampl normal del cerebroES (B y C). Grandes agregados fueron detectados sólo en P2 de muestras normales (C).

Figura 4. Detección de varios fragmentos IPRP resistentes PK-g5p en preparaciones enriquecidas de cerebros normales humanos. Las muestras enriquecidas por g5p se trataron con PK y PNGasa F antes de la transferencia Western sondeo con 1E4 (panel izquierdo), 1E4 pre-incubadas con un péptido sintético que tenía una secuencia idéntica a la del epítopo 1E4 (panel central), y (anti-C panel derecho). 1E4 detectaron tres fragmentos resistentes a PK-PrP denominado PrP * ^20, * ¹⁹ PrP, PrP y * ⁷ (panel izquierdo). Tras el bloqueo de 1E4 con el péptido, no se detectaron ^PrPres (panel central), lo que indica que las bandas detectadas con 1E4 son fragmentos de PRP. Anti-C reveló dos adición resistentes PK-fragmentos PrP denomina PrP * ¹⁸ y PrP-CTF12 /13, además de PrP * ^20.

No hay conflictos de interés declarado.