Una nueva especie de proteína priónica celular (PrP C) Ha sido recientemente identificado en cerebros humanos no infectados utilizando los métodos descritos aquí. Estos métodos se pueden utilizar para aislar las diversas especies de PrP, mientras que algunos de ellos son también útiles en el aislamiento de otros agregados de proteínas mal plegadas a partir de cerebros humanos.
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Artículo de método
Aislamiento de oligómeros de PrP soluble e insoluble en el cerebro humano normal
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Resumen
Resumen
El evento central en la patogénesis de las enfermedades priónicas implica una conversión de la codificada por el hospedador celular de la proteína priónica PrP C en su isoforma patógena PrP Sc 1. PrP C es soluble en detergente y sensible a la proteinasa K (PK)-digestión, mientras que PrP Sc formas insolubles en detergente y los agregados es parcialmente resistente a PK 2-6. La conversión de PrP C a PrP Sc se sabe que implican una transición conformacional de α-helicoidal de las estructuras de lámina β-de la proteína. Sin embargo, en la vía in vivo es aún poco conocida. A endógeno tentativo PrP Sc, intermedio * PrP o "prion silenciosa", aún no se ha identificado en el cerebro infectado 7.
Usando una combinación de enfoques biofísicos y bioquímicos, hemos identificado insolubles agregados de PrP C (designado IPRP C) a partir de cerebros de mamíferos y no infectadas cultivadas neuronallas células 8, 9. Aquí, se describen procedimientos detallados de estos métodos, incluyendo ultracentrifugación en tampón detergente, sedimentación sacarosa paso gradiente, cromatografía de exclusión de tamaño, el enriquecimiento IPRP por proteína del gen 5 (g5p) que se unen específicamente a las formas de PrP alterado estructuralmente, 10 y PK-tratamiento. La combinación de estos enfoques no sólo aísla insoluble PrP Sc y los agregados de PrP C pero también oligómeros solubles PrP C a partir de cerebro humano normal. Dado que los protocolos descritos aquí se han utilizado para aislar tanto PrP Sc de los cerebros infectados y IPRP C de cerebros infectados, que nos brindan la oportunidad de comparar las diferencias en las características físico-químicas, neurotoxicidad y de infectividad entre las dos isoformas. Tal estudio mejorará en gran medida nuestra comprensión de los patógenos proteínicas infecciosas. La fisiología y la fisiopatología de IPRP C no están claros en la actualidad. En particular, en un recién-identified enfermedad priónica humana denominada variable sensible a la proteasa prionopathy, hemos encontrado una nueva PrP Sc que comparte el comportamiento inmunorreactiva y la fragmentación con IPRP C 11, 12. Por otra parte, hemos demostrado que la IPRP C es la principal especie que interactúa con la proteína β-amiloide en la enfermedad de Alzheimer 13. En el mismo estudio, estos métodos se utilizaron para aislar los agregados Abeta y oligómeros en la enfermedad de Alzheimer 13, lo que sugiere su aplicación a los agregados de proteínas priónicas no implicados en otros trastornos neurodegenerativos.
Protocolo
1. Preparación de homogeneizado de cerebro y las fracciones (P2) soluble Detergente-(S2) y Insoluble-
- Tome 100 mg congelado tejido cerebral humano y añadir 100 l de tampón de lisis (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% de Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% de EDTA, pH 7,4).
- Homogeneizarla en hielo usando mano de mortero accionado por un motor sin cuerda, que se congele en hielo seco durante 5 min y se homogeneiza de nuevo utilizando mano de mortero impulsado por las manos primero y luego por el motor, y añadir 300 l o 800 l de tampón de lisis (esto es bien 20 % o 10% homogeneizado de cerebro total, respectivamente).
- Se centrifuga el homogeneizado de 2....
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Discusión
La combinación de los enfoques aquí presentados aísla sistemáticamente agregados insolubles PrP C y PrP C oligómeros solubles del cerebro humano normal. Ultracentrifugación a 100.000 xg durante una hora es un método clásico que ha sido ampliamente utilizado para la separación de la PrP Sc insoluble de la PrP C soluble 14. Aunque es eficaz, una de las precauciones es evitar la contaminación durante la extracción del sobrenadante (S2) después de la centrifugación. Dad.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
La autores agradecen al Cerebro Humano y el Centro de Recursos Spinal Fluid (Los Angeles, CA) para proporcionar muestras normales del cerebro. Este estudio fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R01NS062787, la Fundación de CJD, bioseguridad Alianza, así como el Centro Universitario en Envejecimiento y Salud, con el apoyo de la Fundación McGregor y el Fondo Discrecional del Presidente (Case Western Reserve University) .
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| Fluoruro de fenilmetilsulfonilo | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM en 2-propanol |
| Proteinasa K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg / ml en H 2 O |
| PNGasa F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrífuga LE-80K, rotor SW55 | Beckman Coulter | Ref. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR cuentas | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC sistema | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Marcadores de peso molecular | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Variada |
| Dynabeads M-280 perlas magnéticas | Invitrogen | 143-01 | |
| Anticuerpo 3F4 | Covance | SIG-39600 | |
| Anticuerpo 1E4 | Ciencias de la célula | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl geles prefabricados | Bio-Rad | 345-0020 |
Referencias
- Prusiner, S. B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985)....
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Reimpresiones y permisos
