Aislamiento de oligómeros de PrP soluble e insoluble en el cerebro humano normal

El objetivo de este procedimiento es aislar la proteína priónica soluble e insoluble o PRP de todos los ligamentos en el cerebro humano normal. Esto se logra primero homogenizando el tejido cerebral humano y aislado las fracciones. A continuación, se realiza la sedimentación por velocidad en gradientes escalonados de sacarosa.

Luego se realiza la cromatografía de exclusión por tamaño. Finalmente, el PRP se captura con la proteína del gen cinco o G cinco P. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el aislamiento de PRP o ligamentos solubles e insolubles a partir del cerebro humano normal mediante ultracentrifugación en gradientes escalonados de sacarosa, cromatografía de exclusión por tamaño y captura del PRP con G cinco P. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación de enfermedades priónicas, incluyendo la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, la encefalopatía espongiforme bovina y las enfermedades clínicas de desgaste. Además, puede proporcionar información sobre el aislamiento de proteínas priónicas solubles e insolubles, no solo para enfermedades priónicas, sino también para otras enfermedades como la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson.

Por lo general, las personas nuevas en estos métodos tendrán dificultades porque todos los pasos experimentales son importantes y requieren especial cuidado. La demostración en video de este procedimiento es fundamental, ya que la filtración por exclusión de tamaño (SEC Fi) es muy sensible a la profundidad, y la captura de PRP con G cinco P son pasos difíciles de describir y podrían resultar imprecisos sin una operación más exacta. Para preparar un homogenado cerebral, comience añadiendo 100 microlitros de tampón de lisis a 100 miligramos de tejido cerebral congelado utilizando un pistilo motorizado, homogenice el tejido en hielo, congélelo en hielo seco durante cinco minutos y homogenice nuevamente.

Prepare un homogenado total del cerebro al 20 % o al 10 % añadiendo respectivamente 300 o 800 microlitros de tampón de lisis. Utilizando una centrífuga de banco, centrifugue el homogenado a 1000 G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Recopile la SNA en un rotor S SW 55 y centrifugue la fracción S1 a 35 000 RPM durante una hora a cuatro grados Celsius.

Transfiera el sobrenadante a un tubo limpio para resuspender. Suspender el pellet insoluble en detergente en tampón de lisis para preparar las muestras para la transferencia Western. Incubar las fracciones S2 y P2 con 50 microgramos por mililitro de proteinasa K durante una hora a 37 grados Celsius.

Detenga la digestión añadiendo PMSF a cinco milimolar y tampón de muestra SDS. Hierva las muestras durante 10 minutos y déjelas enfriar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Para realizar la sedimentación por velocidad, comience incubando 450 microlitros de la fracción S20% con un volumen igual de agua con Sarco X 2% en hielo durante 30 minutos en tubos de centrífuga de cinco mililitros. Añada 0,5 mililitros de cada uno de los siguientes porcentajes de sacarosa: 60, 30, 25, 20, 15 y 10%. Coloque 0,4 mililitros de la muestra S incubada sobre la parte superior del gradiente de sacarosa del 10 al 60%.

Centrifugar gradientes escalonados en un rotor SW 55 a 48.000 RPM durante una hora a cuatro grados Celsius desde la parte superior del tubo. Recoger 12 fracciones iguales de 283 microlitros cada una. Utilizar 20 microlitros de cada fracción y un volumen igual de tampón de muestra SDS.

Para preparar las muestras de gel SDS-PAGE. Incube las muestras a ebullición durante 10 minutos, luego enfríelas durante cuatro minutos. Centrifugue las muestras a 1000 G durante un minuto.

Luego, vortexéelos antes de cargarlos en un gel precolado de exclusión por tamaño. Se utiliza cromatografía para determinar el estado oligomérico de las moléculas de PRP. Comience cargando volúmenes de muestra de 200 microlitros de siete marcadores individuales de masa molecular en una columna de 1 por 30 de perlas SUEx 200 HR.

Utilice el volumen eluyente de dextrano azul como volumen de exclusión. Calcule los volúmenes eluyentes pico de VE a partir del cromatograma y las retenciones fraccionales. Calcule KAV, el coeficiente de partición, utilizando la ecuación KAV igual a V menos V cero sobre VT menos V cero.

Para generar una curva de calibración, grafique el KAV de los patrones de proteínas frente al logaritmo del peso molecular de los patrones. A continuación, aplique 200 microlitros de S uno a la columna a un flujo de 0,25 mililitros por minuto.

Lave la columna con tampón de lisis al 1 % y, utilizando un colector de fracciones, eluya fracciones de 0,25 mililitros. Incube 125 microlitros de cada fracción con 500 microlitros de metanol previamente enfriado a menos 20 grados Celsius durante dos horas. Centrifugue las muestras a 13 000 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.

Reese, disuelva el pellet en 20 microlitros de tampón muestral SDS y hiérvalo durante 10 minutos. Enfríe a temperatura ambiente y separe en geles de poliacrilamida al 15 %. Utilice la curva patrón para extrapolar los pesos moleculares de las diversas especies de PRP recuperadas para conjugar la molécula G cinco P a las perlas magnéticas.

Incube 100 microgramos de G cinco P con 350 microlitros de perlas magnéticas activadas con toci en un mililitro de PBS a 37 grados Celsius durante 20 horas. Utilice un imán externo para atraer las perlas de G cinco P a la pared lateral de los tubos eppendorf y retire la solución. Lave las perlas tres veces con un mililitro de PBS al 0,1 % de BSA para bloquear la unión no específica.

Incube las perlas conjugadas con G cinco P en un mililitro de tris 0,2 molar, HCl pH 7,4 que contenga BSA al 0,1 % durante cinco horas a 37 grados Celsius. Luego lave las perlas tres veces. Retire la última lavada y agregue un mililitro de PBS para aislar PRP; incube 100 microlitros de S uno o P dos con 60 microlitros de perlas conjugadas con G cinco B en un mililitro de tampón de unión bajo rotación constante durante tres horas a temperatura ambiente.

Coloque el tubo en el imán. Retire la solución y lave las perlas tres veces con tampón de lavado. Retire el último lavado y agregue tampón muestral de SDS.

Caliente las perlas a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Cargue las muestras en geles precolados al 15% y corra a 150 voltios durante aproximadamente 80, 80 minutos. Transfiera las proteínas a PVDF a 70 voltios durante dos horas después de bloquear las membranas en leche al 5% en TBST.

Incubar durante dos horas a temperatura ambiente con los anticuerpos PRP. Tres F cuatro uno E cuatro anti N o anti C tras la incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP, incubar la membrana con la solución de quimioluminiscencia según las instrucciones del fabricante y exponer la película como se observa aquí en comparación con muestras esporádicas de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob o EJC. Se detectó una pequeña cantidad de PRP celular insoluble en la fracción P dos procedente de cerebros normales.

Sin embargo, la mayor parte se recuperó en la fracción S2. La PRP insoluble representa aproximadamente del cinco al 25 % de la PRP total, incluyendo especies de longitud completa y truncadas en los extremos. Los análisis mediante sedimentación en gradiente escalonado de sacarosa revelaron que, aunque la mayor parte de la PRPC procedente de cerebros no afectados por la EJC se recuperó en las fracciones superiores, también se detectaron pequeñas cantidades de PRP en las fracciones inferiores (nueve a once), que normalmente contienen agregados grandes. Una variedad de especies patógenas de PRP o PRP SC, que van desde monómeros

Se aislaron ligamentos más pequeños y agregados más grandes mediante filtración en gel en el cerebro con la enfermedad de la válvula CRUT yakup. Sorprendentemente, también se detectó una pequeña cantidad de agregados más grandes con un peso molecular superior a 2000 kilodalton en fracciones insolubles de cerebros normales. Además, los dímeros y tetrámeros de PRPC no solo se detectaron en fracciones insolubles, sino también en fracciones insolubles.

Después del tratamiento con PK y P NGAs. El PRP capturado por G cinco P se detectó con el anticuerpo uno E cuatro contra PRP 97 1 0 5 3. Se detectaron fragmentos centrales resistentes a PK denominados PRP asterisco 20, PRP asterisco 19 y PRP asterisco siete, que migraron a 20 kilodaltons, 19 kilodaltons y 7 kilodaltons, respectivamente.

Sin embargo, no se detectó PRP cuando el anticuerpo uno E cuatro se preincubó con un péptido sintético que tiene una secuencia idéntica al epítopo uno E cuatro, lo que indica que las bandas detectadas por el anticuerpo uno E cuatro son fragmentos de PRP. El anticuerpo anti C detectó dos fragmentos diferentes de PRP que migran alrededor de 18 kilodalton y alrededor de 12 a 13 kilodalton. Además del método PRP ETE 20 Una vez.

Esta técnica puede realizarse en cuatro días si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar la PRP poligámica soluble e insoluble en el cerebro humano inferior tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para la investigación sobre el destino de la PRP antes de explorar la información de confirmación de PIP en el cerebro.