Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

Summary

En este estudio, se describe un protocolo mejorado para una micromatriz anticuerpo multiplexado de alto rendimiento con el método de detección de lectina que se puede utilizar en perfiles de glicosilación de proteínas específicas. Este protocolo incluye nuevos reactivos fiables y reduce significativamente el tiempo, el coste y los requisitos de equipos de laboratorio, en comparación con el procedimiento anterior.

Abstract

En este estudio, describimos un protocolo eficaz para su uso en un microarray de anticuerpos multiplexado de alto rendimiento con detección de proteínas de unión a glicanos que permite el perfil de glicosilación de proteínas específicas. La glicosilación de las proteínas es la modificación postraduccional más prevalente que se encuentra en las proteínas y conduce a diversas modificaciones de las propiedades físicas, químicas y biológicas de las proteínas. Debido a que la maquinaria de glicosilación es particularmente susceptible a la progresión de la enfermedad y a la transformación maligna, la glicosilación aberrante ha sido reconocida como biomarcadores de detección temprana para el cáncer y otras enfermedades. Sin embargo, los métodos actuales para estudiar la glicosilación de proteínas suelen ser demasiado complicados o costosos para su uso en la mayoría de los entornos clínicos o de laboratorio normales, y se necesita un método más práctico para estudiar la glicosilación de proteínas. El nuevo protocolo descrito en este estudio hace uso de un microarray de anticuerpos bloqueados químicamente con detección de proteínas de unión a glicanos (GBP) y reduce significativamente el tiempo, el costo y los requisitos de equipo de laboratorio necesarios para estudiar la glicosilación de proteínas. En este método, se imprimen múltiples anticuerpos específicos de glicoproteína inmovilizados directamente en los portaobjetos del microarray y se bloquean los N-glicanos de los anticuerpos. Los anticuerpos específicos de glicoproteína bloqueados e inmovilizados son capaces de capturar y aislar glicoproteínas de una muestra compleja que se aplica directamente sobre los portaobjetos de microarrays. La detección de glicanos se puede realizar mediante la aplicación de lectinas biotiniladas y otras GBP al portaobjetos de microarray, mientras que los niveles de unión se pueden determinar utilizando Dylight 549-Streptavidin. Mediante el uso de un panel de anticuerpos y el sondaje con múltiples lectinas biotiniladas, este método permite desarrollar un perfil de glicosilación eficaz de las diferentes proteínas que se encuentran en una determinada muestra humana o animal.

Introducción

La glicosilación de una proteína, que es la modificación postraduccional más ubicua en las proteínas, modifica las propiedades físicas, químicas y biológicas de una proteína, y desempeña un papel fundamental en varios procesos biológicos^1-6. Debido a que la maquinaria de glicosilación es particularmente susceptible a la progresión de la enfermedad y a la transformación maligna, la glicosilación aberrante ha sido reconocida como biomarcadores de detección temprana para el cáncer y otras enfermedades ^7-12. De hecho, la mayoría de los biomarcadores actuales del cáncer, como la fracción L3 de la fetoproteína α-1 (AFP) para el carcinoma hepatocelular ^13-15 y el CA199 para el cáncer de páncreas ^{16, 17}, son todos fracciones de glicanos aberrantes en las glicoproteínas. Sin embargo, los métodos para estudiar la glicosilación de proteínas han sido complicados y no son adecuados para entornos clínicos y de laboratorio de rutina. Chen et al. han inventado recientemente un microarray de anticuerpos químicamente bloqueados con un método de detección de proteínas de unión a glicanos (GBP) para la glicosilación de alto rendimiento y perfil multiplexado de glicoproteínas nativas en una muestra compleja ¹⁸. En este método de microarrays basado en la afinidad, múltiples anticuerpos específicos de glicoproteínas inmovilizados capturan y aíslan glicoproteínas de la mezcla compleja directamente en el portaobjetos de microarrays, y los glicanos de cada proteína capturada individual se miden en GBP. Debido a que todos los anticuerpos normales contienen N-glicanos que podrían ser reconocidos por la mayoría de los GBP, el paso crítico de este método es bloquear químicamente los glicanos de los anticuerpos para que no se unan a GBP. En el procedimiento, los grupos ci s-diol de los glicanos de los anticuerpos se oxidaron primero a grupos aldehído mediante el uso de NaIO₄ en tampón de acetato de sodio evitando la luz. A continuación, los grupos aldehído se conjugaron con el grupo hidrazida de un reticulante, el ácido 4-(4-N-Maleimidofenil)butírico hidrazida HCl (MPBH), seguido de la conjugación de un dipéptido, Cys-Gly, con el grupo maleimida del MPBH. Por lo tanto, los grupos cis-diol en los glicanos de los anticuerpos se convirtieron en grupos no hidroxilo voluminosos, lo que dificultó la unión de las lectinas y otras GBP a los anticuerpos de captura. Este procedimiento de bloqueo hace que las GBP y las lectinas se unan solo a los glicanos de las proteínas capturadas. Después de este bloqueo químico, las muestras de suero se incubaron con el microarray de anticuerpos, seguido de la detección de glicanos mediante el uso de diferentes lectinas biotiniladas y GBPs, y se visualizaron con Cy3-estreptavidina. El uso paralelo de un panel de anticuerpos y el sondaje de múltiples lectinas proporciona perfiles de glicosilación discretos de múltiples proteínas en una muestra dada ^18-20. Este método se ha utilizado con éxito en múltiples laboratorios diferentes ^{1, 7, 13, 19-31}. Sin embargo, la estabilidad de MPBH y Cys-Gly, procedimiento complicado y prolongado en este método, afecta la reproducibilidad, efectividad y eficiencia del método. En este nuevo protocolo, reemplazamos tanto MPBH como Cys-Gly con un reactivo hidrazida de ácido glutámico mucho más estable (Glu-hydrazide), lo que mejoró significativamente la reproducibilidad del método, simplificó y acortó todo el procedimiento para que pueda completarse en un día hábil. En este nuevo protocolo, describimos el procedimiento detallado del protocolo que puede ser fácilmente adoptado por los laboratorios normales para el estudio rutinario de la glicosilación de proteínas y las técnicas que son necesarias para obtener resultados reproducibles y repetibles.

Protocol

1. Imprimir un microarray de anticuerpos para el ensayo

1. Diluir todos los anticuerpos a 0,5 mg / ml en solución salina de tampón fosfato, pH 7,2 (PBS).
2. Alícuota de 40 l de cada anticuerpo en la placa de la fuente de 384 pocillos.
3. Coloque la placa de fuente de 384-y en el microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
4. Carga de 20 diapositivas de microarrays de PATH en el microarrayer como blanco.
5. Ajuste el microarrayer para imprimir 48 subarreglos idénticos, en el que 27 anticuerpos y las proteínas de control detectadas por triplicado en un patrón de 9x9 (Figura 1E, 1F).
6. Inicie el microarrayer para im....

Discussion

1. Objetivo de proteínas y selección de anticuerpos de captura

Antes del ensayo de microarrays de anticuerpos, algunos reactivos y materiales son necesarios para ser considerado y preparado. Para diseñar un microarray de anticuerpos para el perfil de glicano o cribado glicano biomarcador, un panel de anticuerpos específicos a los candidatos la glicoproteína debe determinarse de acuerdo a la literatura o de los resultados anteriores. Estos anticuerpos fueron adquiridos por lo general de diferent.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Identificación	Nombre del reactivo	Abreviación	Empresa	Catálogo #
L1	Biotinilado Concanavalina A	ConA	Vector Laboratories	BK-1000
L2	Biotinilado lectina Sambucus nigra	SNA	Vector Laboratories	B-1305
L3	Biotinilado Lens culinaris aglutinina	LCA	Vector Laboratories	BK-2000
L4	Biotinylated aglutinina de Ricinus communis que	RCA	Vector Laboratories	BK-1000
L5	Biotinilado Aleuria Aurantia lectina	AAL	Vector Laboratories	B-1395
L6	Biotinilado Erythrina crista lectina	ECL	Vector Laboratories	BK-3000
L7	Biotinilado Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina II	GSL II	Vector Laboratories	BK-3000
L8	Biotinilada aglutinina de germen de trigo	Ventajas de Windows Original	Vector Laboratories	BK-1000
L9	Erythroagglutinin biotinilado Phaseolus vulgaris	PHA-E	Vector Laboratories	BK-2000
L10	Leucoaglutinina biotinilado Phaseolus vulgaris	PHA-L	Vector Laboratories	BK-2000
L11	Aglutinina de maní biotinilado	ANP	Vector Laboratories	BK-1000
L12	Biotinylated Pisum sativum aglutinina	PSA	Vector Laboratories	BK-2000
L13	Biotinilado Dolichos biflorus aglutinina	DBA	Vector Laboratories	BK-1000
L14	Datura stramonium lectina biotinilada	DSL	Vector Laboratories	BK-3000
L15	Biotinilado aglutinina Sophora japónica	SJA	Vector Laboratories	BK-2000
L16	Aglutinina de soja biotinilado	SBA	Vector Laboratories	BK-1000
L17	Biotinilado Solanum tuberosum (papa) lectina	STL	Vector Laboratories	BK-3000
L18	Biotinilado Griffonia (Bandaeiraea) Simplicifolia me lectina	GSL I	Vector Laboratories	BK-2000
L19	Biotinilado Vicia villosa lectina	VVL	Vector Laboratories	BK-2000
L20	Biotinilado Lycopersicon esculentum (tomate) lectina	LEL	Vector Laboratories	BK-3000
L21	Ulex europaeus biotinilado aglutinina I	UEA I	Vector Laboratories	BK-1000
L22	Biotinilado jacalin	Jacalin	Vector Laboratories	BK-3000
A1	F cabra (ab ') 2 Fragmento de IgM anti-humano, el anticuerpo Fc5μ	IgM	Jackson Immuno Research	109-006-129
A2	Burro F (ab ') 2 Frag anti-IgG humana (H + L) untibody	AB1	Jackson Immuno Research	709-006-149
A3	Ratón anti-humano IgG F (ab ') 2 anticuerpo monoclonal	AB3	Jackson Immuno Research	209-005-097
A4	Cabra anti-humano alfa 2 macroglobulina anticuerpo policlonal	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	Conejo anti-humana de alfa-1-antitripsina anticuerpo policlonal	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Ratón anti-humano alfa-1-antitripsina anticuerpo monoclonal	A1AT	Sigma Aldrich	SAB4200198
A7	Conejo anti-humana de alfa-1-antitripsina anticuerpo policlonal	ACT	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	Conejo anti-humanaalfa-1-antiquimotripsina anticuerpo policlonal	ACT	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Ratón anti-transferrina humana anticuerpo monoclonal	La transferrina	GeneTex	GTX101035
A10	Conejo anti-transferrina humana anticuerpo policlonal	La transferrina	GeneTex	GTX77130
A11	Cabra anti-humano apolipoproteína J anticuerpo policlonal	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	Ratón anti-humano GP73 anticuerpo monoclonal	GP73	Abbott	14H4-23
A13	Ratón anti-humano GP73 anticuerpo monoclonal	GP73	Santa Cruz de Biotecnología INC	sc-101275
A14	Conejo anti-humana de alfa-1 fetoprotein anticuerpo policlonal	AFP	Genway	GWB-41C966
A15	Ratón anti-humano alfa-1-fetoproteína anticuerpo monoclonal	AFP	Fitzgerald	10-A05A
A16	Ratón anti-humano hemopexina anticuerpo monoclonal	Hemopexin	Assaypro	60190-05011
A17	Ratón anti-humano glipicano-3 (1G12) del anticuerpo monoclonal	GPL3	Santa Cruz Bio	sc-65443
A18	Ratón anti-humano Quininógeno (BPM) del anticuerpo monoclonal	Quininógeno	Assaypro	20333-05011
A19	Conejo anti-humano MMP-21 anticuerpo monoclonal	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Ratón anti-humano CEACAM-1 anticuerpos monoclonalesy	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
A21	Rata anti-humano DPPIV/CD26 anticuerpo monoclonal	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Ratón anti-humano PIVKA II anticuerpo monoclonal	PIVICA	Crystal química	8040
A23	Mouse anti-antígeno carcinoembrionario	CEA	EE.UU. biológica	C1300
A24	Mouse anti-cáncer de antígeno CA125	CA125	EE.UU. biológica	C0050-01D
A25	Mouse anti-CA19-9 del cáncer de antígeno	CA19-9	EE.UU. biológica	C0075-18
A26	Ratón anti-Lewis x anticuerpo monoclonal	Lewis X	Calbiochem	434631
bio	Biotinilada BSA (control positivo)	Bio	Hecho en casa	N / A

Nombre de los equipos o el reactivo s	Empresa	Número de catálogo
Microarrayer sin contacto	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 microplaca	Pescador	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultrafino de nitrocelulosa Coate microarrays se desliza	Gentel	TRAYECTORIA
Slide Imprinter (opcional)	La Compañía de gel	WSP60-1
Shaker	Pescador	15-453-211
Centrifugar	Eppendorf	5804 000.013
Deslice el lavabo / Slide tinción Plato con bastidor extraíble	Pescador	08-812
La incubación de diapositivas de cámara / caja portaobjetos del microscopio	Pescador	03-448-5
Brij 35, 30 w / v% en agua	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20 al	Pescador	P337-100
Peryodato de sodio (NaIO 4)	Sigma	311448
L-glutámico ácido γ-hidrazida	Sigma	G-7257
Acetato de sodio anhidro (CH3COONa)	Sigma	S2889
Albúmina de Suero Bovino (BSA)	Lampire Biológica Labs	7500804
Tampón fosfato salino (PBS) (10 veces)	Denville Científico	CP4390-48
DyLight 549 neutravidin conjugado	Thermo	22837
Inhibidor de la proteasa cóctel comprimidos	Roche	4693159001
ChromPure IgG humana, fragmento Fc	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure IgG humana, toda la molécula	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure IgG de ratón, toda la molécula	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure IgG de ratón, fragmento Fc	Jackson Immunoresearch	015-000-008
ChromPure IgG de conejo, molécula entera	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure burro IgG, molécula entera	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Microarray Scanner	Tecan	LS Reloaded