Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

Summary

En este estudio, se describe un protocolo mejorado para una micromatriz anticuerpo multiplexado de alto rendimiento con el método de detección de lectina que se puede utilizar en perfiles de glicosilación de proteínas específicas. Este protocolo incluye nuevos reactivos fiables y reduce significativamente el tiempo, el coste y los requisitos de equipos de laboratorio, en comparación con el procedimiento anterior.

Abstract

En este estudio, describimos un protocolo eficaz para su uso en un microarray de anticuerpos multiplexado de alto rendimiento con detección de proteínas de unión a glicanos que permite el perfil de glicosilación de proteínas específicas. La glicosilación de las proteínas es la modificación postraduccional más prevalente que se encuentra en las proteínas y conduce a diversas modificaciones de las propiedades físicas, químicas y biológicas de las proteínas. Debido a que la maquinaria de glicosilación es particularmente susceptible a la progresión de la enfermedad y a la transformación maligna, la glicosilación aberrante ha sido reconocida como biomarcadores de detección temprana para el cáncer y otras enfermedades. Sin embargo, los métodos actuales para estudiar la glicosilación de proteínas suelen ser demasiado complicados o costosos para su uso en la mayoría de los entornos clínicos o de laboratorio normales, y se necesita un método más práctico para estudiar la glicosilación de proteínas. El nuevo protocolo descrito en este estudio hace uso de un microarray de anticuerpos bloqueados químicamente con detección de proteínas de unión a glicanos (GBP) y reduce significativamente el tiempo, el costo y los requisitos de equipo de laboratorio necesarios para estudiar la glicosilación de proteínas. En este método, se imprimen múltiples anticuerpos específicos de glicoproteína inmovilizados directamente en los portaobjetos del microarray y se bloquean los N-glicanos de los anticuerpos. Los anticuerpos específicos de glicoproteína bloqueados e inmovilizados son capaces de capturar y aislar glicoproteínas de una muestra compleja que se aplica directamente sobre los portaobjetos de microarrays. La detección de glicanos se puede realizar mediante la aplicación de lectinas biotiniladas y otras GBP al portaobjetos de microarray, mientras que los niveles de unión se pueden determinar utilizando Dylight 549-Streptavidin. Mediante el uso de un panel de anticuerpos y el sondaje con múltiples lectinas biotiniladas, este método permite desarrollar un perfil de glicosilación eficaz de las diferentes proteínas que se encuentran en una determinada muestra humana o animal.

Introducción

La glicosilación de una proteína, que es la modificación postraduccional más ubicua en las proteínas, modifica las propiedades físicas, químicas y biológicas de una proteína, y desempeña un papel fundamental en varios procesos biológicos^1-6. Debido a que la maquinaria de glicosilación es particularmente susceptible a la progresión de la enfermedad y a la transformación maligna, la glicosilación aberrante ha sido reconocida como biomarcadores de detección temprana para el cáncer y otras enfermedades ^7-12. De hecho, la mayoría de los biomarcadores actuales del cáncer, como la fracción L3 de la fetoproteína α-1 (AFP) para el carcinoma hepatocelular ^13-15 y el CA199 para el cáncer de páncreas ^{16, 17}, son todos fracciones de glicanos aberrantes en las glicoproteínas. Sin embargo, los métodos para estudiar la glicosilación de proteínas han sido complicados y no son adecuados para entornos clínicos y de laboratorio de rutina. Chen et al. han inventado recientemente un microarray de anticuerpos químicamente bloqueados con un método de detección de proteínas de unión a glicanos (GBP) para la glicosilación de alto rendimiento y perfil multiplexado de glicoproteínas nativas en una muestra compleja ¹⁸. En este método de microarrays basado en la afinidad, múltiples anticuerpos específicos de glicoproteínas inmovilizados capturan y aíslan glicoproteínas de la mezcla compleja directamente en el portaobjetos de microarrays, y los glicanos de cada proteína capturada individual se miden en GBP. Debido a que todos los anticuerpos normales contienen N-glicanos que podrían ser reconocidos por la mayoría de los GBP, el paso crítico de este método es bloquear químicamente los glicanos de los anticuerpos para que no se unan a GBP. En el procedimiento, los grupos ci s-diol de los glicanos de los anticuerpos se oxidaron primero a grupos aldehído mediante el uso de NaIO₄ en tampón de acetato de sodio evitando la luz. A continuación, los grupos aldehído se conjugaron con el grupo hidrazida de un reticulante, el ácido 4-(4-N-Maleimidofenil)butírico hidrazida HCl (MPBH), seguido de la conjugación de un dipéptido, Cys-Gly, con el grupo maleimida del MPBH. Por lo tanto, los grupos cis-diol en los glicanos de los anticuerpos se convirtieron en grupos no hidroxilo voluminosos, lo que dificultó la unión de las lectinas y otras GBP a los anticuerpos de captura. Este procedimiento de bloqueo hace que las GBP y las lectinas se unan solo a los glicanos de las proteínas capturadas. Después de este bloqueo químico, las muestras de suero se incubaron con el microarray de anticuerpos, seguido de la detección de glicanos mediante el uso de diferentes lectinas biotiniladas y GBPs, y se visualizaron con Cy3-estreptavidina. El uso paralelo de un panel de anticuerpos y el sondaje de múltiples lectinas proporciona perfiles de glicosilación discretos de múltiples proteínas en una muestra dada ^18-20. Este método se ha utilizado con éxito en múltiples laboratorios diferentes ^{1, 7, 13, 19-31}. Sin embargo, la estabilidad de MPBH y Cys-Gly, procedimiento complicado y prolongado en este método, afecta la reproducibilidad, efectividad y eficiencia del método. En este nuevo protocolo, reemplazamos tanto MPBH como Cys-Gly con un reactivo hidrazida de ácido glutámico mucho más estable (Glu-hydrazide), lo que mejoró significativamente la reproducibilidad del método, simplificó y acortó todo el procedimiento para que pueda completarse en un día hábil. En este nuevo protocolo, describimos el procedimiento detallado del protocolo que puede ser fácilmente adoptado por los laboratorios normales para el estudio rutinario de la glicosilación de proteínas y las técnicas que son necesarias para obtener resultados reproducibles y repetibles.

Protocol

1. Imprimir un microarray de anticuerpos para el ensayo

1. Diluir todos los anticuerpos a 0,5 mg / ml en solución salina de tampón fosfato, pH 7,2 (PBS).
2. Alícuota de 40 l de cada anticuerpo en la placa de la fuente de 384 pocillos.
3. Coloque la placa de fuente de 384-y en el microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
4. Carga de 20 diapositivas de microarrays de PATH en el microarrayer como blanco.
5. Ajuste el microarrayer para imprimir 48 subarreglos idénticos, en el que 27 anticuerpos y las proteínas de control detectadas por triplicado en un patrón de 9x9 (Figura 1E, 1F).
6. Inicie el microarrayer para imprimir las diapositivas de microarrays de anticuerpos.
7. Recoge las diapositivas de microarrays de anticuerpos, y almacenarlos en cassette de diapositivas con desecante. Pase la aspiradora sellar el cartucho en una bolsa de plástico mediante el uso de sellador al vacío (FoodSaver).
8. Almacenar las diapositivas microarray cerrados a 4 ° C en el refrigerador.

2. Químicamente Bloquear el microarray de anticuerpos para prevenir EURLa unión a los anticuerpos de captura

El ensayo de microarrays se inicia una vez que las diapositivas de microarrays son químicamente bloqueado y tiene una duración de unas 8 horas. Una vez iniciado el ensayo de microarrays ha de ser completado (los pasos 2 a 8).

1. Tome los microarrays se desliza fuera de la nevera, y equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
2. Retire la corredera de la caja de almacenamiento y brevemente enjuague con tampón fosfato salino pH 7,2 con Tween 20 al 0,1% (PBST0.1) una vez en una diapositiva de lavabo, y luego en 15 mM de sodio pH 5,0 con tampón de acetato de 0,1% de Tween (CBT0 0.1) de una manera secuencial. Incubar los portaobjetos en CBT0.1 durante 10 minutos en la cuenca de diapositivas de lavado.
3. Preparar fresca 150 mM _NaIO4 en 15 mM de tampón acetato de sodio pH 5,0 (CB), y guárdelo en en una diapositiva de lavabo en un refrigerador, evitando la luz antes de su uso.
4. Retire el portaobjetos de la CB, y lo puso en la cuenca que contiene frescos _NaIO4 con la cara de anticuerposhacia arriba. Cubra el recipiente con papel de aluminio para evitar la luz, y se incuba la cuenca de diapositivas durante 2 horas con agitación suave a 4 ° C en un refrigerador.
5. Preparar 300 ml de 10 mM de ácido glutámico hidrazida (el bloqueador) en el CB.
6. Retire la corredera de la cuenca, y enjuagarlo brevemente en el CB 3 veces durante 5 minutos cada vez, en la cuenca de diapositivas de lavado.
7. Incubar las diapositivas en el bloqueador en una pileta de lavar durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave.
8. Retire las diapositivas de la cuenca, y los lavarás con PBST0.1 durante 3 minutos.

3. Bloquear no específicas de enlaces para la Microarray con albúmina sérica bovina (BSA)

1. Preparar 300 ml de BSA al 1% en tampón fosfato pH 7,2 con solución salina al 0,5% de Tween (PBST0.5) en una cuenca de diapositivas de lavado, y se incuba la diapositiva microarrays en la cuenca durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave.
2. Enjuague los portaobjetos en PBST0.1 tres veces durante 3 minutos cada vez.
3. Coloque la diapositivaen un estante de la diapositiva, y giran a 1.200 xg en una centrifugación durante 2 minutos para secar la diapositiva de microarrays.

4. Pie de imprenta Red de Cera en la diapositiva de microarrays para separar cada submatriz

1. Pre-calentar el impresor de cera a 70 ° C durante 5 minutos.
2. Cargue el microarreglo bloqueado en el impresor de cera con la cara de anticuerpos frente a la cera. Retire con cuidado el mango a la cera de sello en la diapositiva de manera uniforme.

5. Aplicar las muestras de suero en el microarreglo

1. Durante el Paso 2.4, preparar las muestras de suero para el ensayo de cualquiera de los perfiles glico en una muestra (5.1.1), o la única medición de glico epiptope entre las múltiples muestras (5.1.2).
   1. En un experimento para los profilings glicanos de glicoproteínas séricas múltiples en una sola muestra de suero mediante el uso de múltiples Gbps (véase el experimento muestra 1), muestras de suero se aplica en todos los subcampos. En este caso, 40 l de suero amplio se diluye en 360 l de PBS que contenía 0,1%Tween-20, 0,1% de Brij 35, 100 ug / ml de IgG de ratón, 100 ug / ml de IgG de rata, 100 ug / ml de IgG de conejo, 100 ug / ml de IgG de cabra y 100 ug / ml de IgG de burro. Este volumen es suficiente para la aplicación de 6 l de solución de suero diluido en cada submatriz.
   2. En un experimento para la medición de un glicano en varias proteínas del suero entre múltiples muestras de suero mediante el uso de una detecciones GBP (véase el experimento muestra 2). En este caso, 1 l de suero amplio se diluye en 9 l de PBS que contenía 0,1% de Tween-20, 0,1% de Brij 35, 100 ug / ml de IgG de ratón, 100 ug / ml de IgG de rata, 100 ug / ml de IgG de conejo , 100 mg / ml de IgG de cabra y 100 ug / ml de IgG de burro. Este volumen es suficiente para la aplicación de 6 l de solución de suero diluido en cada submatriz.
2. Después de sello de cera en el paso 4, aplique cuidadosamente 6 ml de muestra diluida o de muestras de control (PBST0.1) a cada submatriz de la diapositiva. Incubar el portaobjetos en un casete humidificado con toallas de papel mojadas a temperatura ambientedurante 1 hora.
3. Enjuague el portaobjetos con PBST0.1 tres veces durante 3 minutos cada vez.
4. Secar el portaobjetos haciéndolo girar a 1200 xg durante 2 minutos.

6. Aplicar biotinilado EUR (anticuerpo de lectina o Anti-glucano) en la diapositiva

1. Durante el Paso 2.4, preparar 10μg/ml de las lectinas con biotina o Gbps en PBST0.1.
   1. En el experimento de perfiles de glicano que la sonda una muestra con las lectinas múltiples (experimento muestra 1), preparar 350 l de la lectina biotinilada que es suficiente para todas las submatrices.
   2. En un solo epítopo glicano / biomarcadores de detección en muestras múltiples mediante el uso de lectinas múltiples, preparar 10 l de cada lectina biotinilada que es suficiente para una submatriz.
2. Aplicar 6 l de la lectina diluida con biotina (s) a cada submatriz de la corredera, y se incuba en el cuadro de diapositivas humidificado con toallas de papel húmedo a temperatura ambiente durante 1 hora.
3. Enjuague los portaobjetos con PBST0.1 tres veces durante 3 minutos cada uno timí.
4. Secar el portaobjetos haciéndolo girar a 1200 xg en centrifugar durante 2 minutos.

7. Aplicar neutravidin Dye etiquetados para la detección de fluorescencia

1. Preparar 350 l de 549 DyLight neutravidin etiqueta que es suficiente para todas las submatrices.
2. Aplicar 6 l de DyLight 549 neutravidin etiquetado en cada submatriz, e incubar el portaobjetos en el cassette deslizante humidificado a temperatura ambiente durante 1 hora.
3. Enjuague el portaobjetos con PBST0.1 tres veces durante 3 minutos cada vez.
4. Seque la diapositiva haciendo girar la que en 1200 xg en centrifugar durante 2 minutos.

8. Obtener imágenes de microarrays de diapositivas mediante el análisis del Slide

1. Busque en la diapositiva mediante el uso de un escáner de fluorescencia de microarrays con una resolución de m 10. Los parámetros del láser y PMT debe ser tan fuerte como sea posible, pero no hay punto de saturación se observa.

9. Extracción de datos y análisis

1. Abra la imagen en ArrayPro 3.2.
Configurar la plantilla de conjunto de acuerdo con el mapa de matriz que muestra los puntos de anticuerpos lugares. Alinear cuidadosamente cada círculo plantilla sobre el punto correspondiente de la imagen.
2. Extraer la intensidad de cada punto en un archivo de Excel para su posterior análisis.

10. Los resultados representativos

Ejemplo Experimento 1

Glicosilación perfiles de múltiples glicoproteínas de suero en la muestra del paciente carcinoma hepatocelular suero mediante el uso de microarrays químicamente bloqueado anticuerpo con detección de lectinas múltiple.

El objetivo de este experimento es estudiar el perfil de glicosilación individual de 20 glicoproteínas en el carcinoma hepatocelular (CHC) de la muestra el suero del paciente mediante el uso de microarrays de anticuerpos bloquean químicamente con la detección de lectina. Un microarray de anticuerpos, que contiene 48 subarreglos idénticos que incluyen 26 anticuerpos y biotina BSA-, fue diseñado y fabricado como se describe en Step 1. Estos anticuerpos fueron 26 contra 20 glicoproteínas de suero que identificados como prometedores valor diagnóstico precoz de pacientes con HCC mediante inmunoprecipitación lectina base combinado con la identificación de proteínas de espectrometría de masa ^{12, 32} como se muestra en la Tabla 1. El patrón y la disposición de las manchas de anticuerpos impresos por triplicado en un representante submatriz se muestra en la Figura 1E y 1F, respectivamente. Dos diapositivas microarrays idénticos, uno no era químicamente bloqueado (Figura 1A), mientras que la otra fue (Figura 1B), se utilizaron para llevar a cabo el experimento glicosilación perfilado mismo con el fin de demostrar la importancia del procedimiento de bloqueo químico para el análisis. Para la diapositiva químicamente bloqueado (Figura 1B), el experimento se inició en el Paso 2, por la diapositiva ninguno químicamente bloqueado (Figura 1A), el experimento se inició a partir del paso 3. El experimento fue llevado por following todos los pasos descritos en el protocolo, excepto para el paso 5.1.2 y 6.1.2. En el Paso 5,2, una muestra de control PBST0.1 se aplicó sobre subarreglos en la columna 1 y 3, y una muestra de suero agrupado CHC se aplicó sobre subarreglos en la columna 2 y 4, respectivamente (como se muestra en la Figura 1G). Esta comparación es mostrar la eficacia, la eficiencia del procedimiento, así como la afinidad de unión al antígeno de los anticuerpos después de bloqueo químico. 22 lectinas biotiniladas (como se muestra en la Tabla 1) que específico para glicanos diferentes ^{18, 20} se aplicaron a cada submatriz como se muestra en la Figura 1G para perfiles de glicosilación. Las imágenes de las químicamente bloqueados (Figura 1B) y bloqueado no químicamente (Figura 1A) micromatrices después del ensayo de perfiles de glicosilación, siguiendo el protocolo. Como se muestra en las submatrices de la columna 1 y 3 de no-químicamente bloqueados microarrays (Figura 1A y 1C Figura), en las quesólo PBST0.1 se aplicó, la mayoría de las lectinas obligado a capturar anticuerpos, y mostró fondo muy alto que comparables a aquellas subarreglos en la columna 2 y 4, en las que se aplicó la muestra de suero. Es imposible obtener información sobre el perfil de este glicano microarrays de diapositivas. Por el contrario, cuando el mismo experimento se realizó sobre un portaobjetos de anticuerpos microarrays químicamente bloqueado, los subarreglos en la columna 1 y 3, en la que sólo se aplicó PBST0.1, la mayoría de las lectinas mostró enlaces no o muy baja para capturar anticuerpos, mientras que el antígeno de alta fijaciones se observaron todavía en subarreglos en la columna 2 y 4, en la que muestra de suero se aplicó (Figura 1B y 1D). Estos resultados mostraron el procedimiento de bloqueo químico era un paso fundamental tanto la medición de los glicanos en las glicoproteínas de anticuerpos capturados. Siguiendo el protocolo, los perfiles de glicosilación de 22 glicoproteínas en HCC suero se puede obtener.

Experimento 2

Pantalla de fucos alteradosylation sobre determinadas glicoproteínas de suero como biomarcadores para la cirrosis hepática y la discriminación pacientes con carcinoma hepatocelular.

El objetivo de este experimento es para la detección de alteraciones en determinadas fucosilación glicoproteínas de suero como biomarcadores que discriminan a la cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular (CHC) de los pacientes. A diferencia del Experimento 1, en la que sólo se aplicó una muestra de suero en cada subarreglos y probaron con diferentes lectinas, en este ensayo, el total de 40 muestras diferentes de suero de HCC y cirrosis pacientes se aplica sobre cada submatriz, y probaron con una lectina (AAL ). El análisis estadístico, como la prueba T, receptor de funcionamiento característico (ROC), se llevó a cabo para evaluar la distribución o el rendimiento diagnóstico de la epiptope glicano / biomarcadores de proteína en cada persona en todas las muestras de suero. Se utilizó el mismo anticuerpo microarrays fabricados en el Experimento 1, excepto para el anti-CA19-9 y anti-anticuerpos de Lewis X en este estudio. La expeperimento se llevó a cabo a partir de 02 de septiembre con el paso 9, excepto para el paso 5.1.1 y 6.1.1. Total de 40 muestras de suero de 20 cirrosis y 20 pacientes con HCC se aplicaron a submatriz aleatoria de los 48 subarreglos junto con las muestras de control de PBS como control negativo. Fucosilación de cada una de las proteínas de los capturados fue detectado mediante el uso de biotina Fucosa específico lectina. La imagen de microarrays muestra en la Figura 1 demuestra la AAL lectina sólo a las proteínas séricas capturados en el microarray (Figura 2D) en lugar de anticuerpos capturados (Figura 2E). Las intensidades de la AAL de unión de todos los puntos fueron extraídos y analizados mediante el uso de T de prueba y las curvas ROC para evaluar el desempeño de la fucosilación (intensidad vinculante AAL) de cada proteína de suero en la discriminación entre los grupos HCC y cirrosis. Los resultados mostraron que la fucosilación de proteína GP73 dio el mejor discriminación entre los dos grupos con una p = 0,03 y el área bajocurva de la curva ROC es igual a 0,72. Este experimento demostró este procedimiento es un método rápido, eficaz para el epítopo glicano / biomarcador cribado en muestras múltiples dentro de múltiples proteínas.

Identificación	Nombre del reactivo	Abreviación	Empresa	Catálogo #
L1	Biotinilado Concanavalina A	ConA	Vector Laboratories	BK-1000
L2	Biotinilado lectina Sambucus nigra	SNA	Vector Laboratories	B-1305
L3	Biotinilado Lens culinaris aglutinina	LCA	Vector Laboratories	BK-2000
L4	Biotinylated aglutinina de Ricinus communis que	RCA	Vector Laboratories	BK-1000
L5	Biotinilado Aleuria Aurantia lectina	AAL	Vector Laboratories	B-1395
L6	Biotinilado Erythrina crista lectina	ECL	Vector Laboratories	BK-3000
L7	Biotinilado Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina II	GSL II	Vector Laboratories	BK-3000
L8	Biotinilada aglutinina de germen de trigo	Ventajas de Windows Original	Vector Laboratories	BK-1000
L9	Erythroagglutinin biotinilado Phaseolus vulgaris	PHA-E	Vector Laboratories	BK-2000
L10	Leucoaglutinina biotinilado Phaseolus vulgaris	PHA-L	Vector Laboratories	BK-2000
L11	Bioaglutinina de maní tinylated	ANP	Vector Laboratories	BK-1000
L12	Biotinylated Pisum sativum aglutinina	PSA	Vector Laboratories	BK-2000
L13	Biotinilado Dolichos biflorus aglutinina	DBA	Vector Laboratories	BK-1000
L14	Datura stramonium lectina biotinilada	DSL	Vector Laboratories	BK-3000
L15	Biotinilado aglutinina Sophora japónica	SJA	Vector Laboratories	BK-2000
L16	Aglutinina de soja biotinilado	SBA	Vector Laboratories	BK-1000
L17	Biotinilado Solanum tuberosum (papa) lectina	STL	Vector Laboratories	BK-3000
L18	Biotinilado Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina I	GSL I	Vector Laboratories	BK-2000
L19	Biotinilado Vicia villosa lectina	VVL	Vector Laboratories	BK-2000
L20	Biotinilado Lycopersicon esculentum (tomate) lectina	LEL	Vector Laboratories	BK-3000
L21	Ulex europaeus biotinilado aglutinina I	UEA I	Vector Laboratories	BK-1000
L22	Biotinilado jacalin	Jacalin	Vector Laboratories	BK-3000
A1	F cabra (ab ') 2 Fragmento de IgM anti-humano, el anticuerpo Fc5μ	IgM	Jackson Immuno Research	109-006-129
A2	Burro F (ab ') 2Frag anti-IgG humana (H + L) de anticuerpos	AB1	Jackson Immuno Research	709-006-149
A3	Ratón anti-humano IgG F (ab ') 2 anticuerpo monoclonal	AB3	Jackson Immuno Research	209-005-097
A4	Cabra anti-humano alfa 2 macroglobulina anticuerpo policlonal	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	Conejo anti-humana de alfa-1-antitripsina anticuerpo policlonal	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Ratón anti-humano alfa-1-antitripsina anticuerpo monoclonal	A1AT	Sigma Aldrich	SAB4200198
A7	Conejo anti-humana de alfa-1-antitripsina anticuerpo policlonal	ACT	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	Conejo anti-humana de alfa-1-Antichymotrypsin anticuerpo policlonal	ACT	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Ratón anti-transferrina humana anticuerpo monoclonal	La transferrina	GeneTex	GTX101035
A10	Conejo anti-transferrina humana anticuerpo policlonal	La transferrina	GeneTex	GTX77130
A11	Cabra anti-humano apolipoproteína J anticuerpo policlonal	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	Ratón anti-humano GP73 anticuerpo monoclonal	GP73	Abbott	14H4-23
A13	Ratón anti-humano GP73 anticuerpo monoclonal	GP73	Santa Cruz de Biotecnología INC	sc-101275
A14	Conejo anti-humana de alfa-1-fetoproteína anticuerpo policlonal	AFP	GenWay	GWB-41C966
A15	Ratón anti-humano alfa-1-fetoproteína anticuerpo monoclonal	AFP	Fitzgerald	10-A05A
A16	Ratón anti-humano hemopexina anticuerpo monoclonal	Hemopexin	Assaypro	60190-05011
A17	Ratón anti-humano glipicano-3 (1G12) del anticuerpo monoclonal	GPL3	Santa Cruz Bio	sc-65443
A18	Ratón anti-humano Quininógeno (BPM) del anticuerpo monoclonal	Quininógeno	Assaypro	20333-05011
A19	Conejo anti-humano MMP-21 anticuerpo monoclonal	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Ratón anti-humano CEACAM-1 anticuerpo monoclonal	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
A21	Rata anti-humano DPPIV/CD26 anticuerpo monoclonal	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Ratón anti-humano PIVKA II anticuerpo monoclonal	PIVICA	Crystal química	8040
A23	Mouse anti-antígeno carcinoembrionario	CEA	EE.UU. biológica	C1300
A24	Mouse anti-cáncer de antígeno CA125	CA125	EE.UU. biológica	C0050-01D
A25	Mouse anti-CA19-9 del cáncer de antígeno	CA19-9	EE.UU. biológica	C0075-18
A26	Ratón anti-Lewis x anticuerpo monoclonal	Lewis X	Calbiochem	434631
bio	Biotinilada BSA (control positivo)	Bio	Hecho en casa	N / A

Tabla 1. Lista de las lectinas y anticuerpos utilizados en este protocolo.

Nombre de los equipos o el reactivo s	Empresa	Número de catálogo
Microarrayer sin contacto	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 microplaca	Pescador	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultrafino de nitrocelulosa Coate microarrays se desliza	Gentel	TRAYECTORIA
Slide Imprinter (opcional)	La Compañía de gel	WSP60-1
Shaker	Pescador	15-453-211
Centrifugar	Eppendorf	5804 000.013
Deslice lavabo / Slide tinción Dish wiº bastidor extraíble	Pescador	08-812
La incubación de diapositivas de cámara / caja portaobjetos del microscopio	Pescador	03-448-5
Brij 35, 30 w / v% en agua	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20 al	Pescador	P337-100
Peryodato de sodio (NaIO 4)	Sigma	311448
L-glutámico ácido γ-hidrazida	Sigma	G-7257
Acetato de sodio anhidro (CH3COONa)	Sigma	S2889
Albúmina de Suero Bovino (BSA)	Lampire Biológica Labs	7500804
Tampón fosfato salino (PBS) (10 veces)	Denville Científico	CP4390-48
DyLight 549 neutravidin conjugado	Thermo	22837
Inhibidor de la proteasa cóctel comprimidos	Roche	4693159001
ChromPure IgG humana, fragmento Fc	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure IgG humana, toda la molécula	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure IgG de ratón, toda la molécula	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure IgG de ratón, fragmento Fc	Jackson Immunoresearch	015-000-008
ChromPure IgG de conejo, molécula entera	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure burro IgG, molécula entera	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Microarray Scanner	Tecan	LS Reloaded

Tabla 2. Listade equipos y reactivos utilizados en este protocolo.

Esquema 1 Un esquema que muestra el microarray de anticuerpos lectina basados ​​en biomarcadores glicano proceso de descubrimiento 1 (Paso 2 a 4): Bloquee el microarray de anticuerpos con el antagonista (Glu-hidrazida) y BSA, 2 (Paso 5):.. Se aplican las muestras de suero y captura glicoproteínas específicas con anticuerpos específicos, 3 (Paso 6): se aplican lectina biotinilada (s), 4 (Paso 7): Sonda de la AAL biotina con DyLight 549 neutravidin etiquetado para microarrays de imágenes.

Figura 1. Microarray imágenes de la creación de perfiles de glicosilación Ejemplo de experimento 1 de múltiples glicoproteínas de suero en la muestra del paciente mediante el uso de suero de HCC isquémicaaliado bloqueado microarrays de anticuerpos con la detección de lectina múltiple. Dos diapositivas de microarrays idénticos, (a) ninguna químicamente bloqueado, o (B) químicamente bloqueado como se describe en el Paso 2, ambos pasaron por todos los pasos del 2 al 9 de perfiles de glicosilación, así como para fines de comparación. (A) y (B) son las imágenes escaneadas a microarrays Paso 8 en una resolución de 10 micras. (C) el zoom a la imagen de las dos primeras filas de la ninguno químicamente bloqueado microarreglo (A), (D) el zoom a la imagen de las dos primeras filas de la no químicamente bloqueado microarreglo (B)), (E) el diagrama de la disposición de anticuerpos dentro de cada submatriz; (F) los mapas de la matriz: la ubicación de cada anticuerpo en el subarreglo, cada nombre de anticuerpos representa 3 puntos; (G) Muestra de suero y la ubicación de lectina: muestra un diagrama que subarreglo cada muestra de suero y lectina se aplicó sobre.

Figura 2. Microarray imágenes delEjemplo de experimento 2 pantalla para fucosilación alterada en determinados glicoproteínas de suero como biomarcadores que discriminan a la cirrosis hepática y los pacientes con CHC. El ensayo de microarrays se llevó a cabo como se describe en el Experimento 2 muestra la sección. (A) La imagen de toda la diapositiva de la diapositiva de microarrays del Paso 8, (B) el diagrama de la disposición de anticuerpos dentro de cada submatriz; (C) de la matriz: los mapas de la ubicación de cada anticuerpo en el subarreglo, cada nombre de anticuerpos representa 3 puntos; (D) un zoom a la imagen de una submatriz que se incubaron con muestra de suero, (E) un zoom a la imagen de una submatriz que fueron incubadas con PBS de control.

Figura 3. Resultados de un experimento de creación de perfiles glicano muestra 1. Cada gráfico de barras representa el perfil de la lectina de unión (o perfiles de glicano) de una de la proteína 20 probada. Total de 22 diferentes lectinas se utilizaron para analizar ºe glicano perfil de cada proteína.

Discussion

1. Objetivo de proteínas y selección de anticuerpos de captura

Antes del ensayo de microarrays de anticuerpos, algunos reactivos y materiales son necesarios para ser considerado y preparado. Para diseñar un microarray de anticuerpos para el perfil de glicano o cribado glicano biomarcador, un panel de anticuerpos específicos a los candidatos la glicoproteína debe determinarse de acuerdo a la literatura o de los resultados anteriores. Estos anticuerpos fueron adquiridos por lo general de diferent...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Identificación	Nombre del reactivo	Abreviación	Empresa	Catálogo #
L1	Biotinilado Concanavalina A	ConA	Vector Laboratories	BK-1000
L2	Biotinilado lectina Sambucus nigra	SNA	Vector Laboratories	B-1305
L3	Biotinilado Lens culinaris aglutinina	LCA	Vector Laboratories	BK-2000
L4	Biotinylated aglutinina de Ricinus communis que	RCA	Vector Laboratories	BK-1000
L5	Biotinilado Aleuria Aurantia lectina	AAL	Vector Laboratories	B-1395
L6	Biotinilado Erythrina crista lectina	ECL	Vector Laboratories	BK-3000
L7	Biotinilado Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina II	GSL II	Vector Laboratories	BK-3000
L8	Biotinilada aglutinina de germen de trigo	Ventajas de Windows Original	Vector Laboratories	BK-1000
L9	Erythroagglutinin biotinilado Phaseolus vulgaris	PHA-E	Vector Laboratories	BK-2000
L10	Leucoaglutinina biotinilado Phaseolus vulgaris	PHA-L	Vector Laboratories	BK-2000
L11	Aglutinina de maní biotinilado	ANP	Vector Laboratories	BK-1000
L12	Biotinylated Pisum sativum aglutinina	PSA	Vector Laboratories	BK-2000
L13	Biotinilado Dolichos biflorus aglutinina	DBA	Vector Laboratories	BK-1000
L14	Datura stramonium lectina biotinilada	DSL	Vector Laboratories	BK-3000
L15	Biotinilado aglutinina Sophora japónica	SJA	Vector Laboratories	BK-2000
L16	Aglutinina de soja biotinilado	SBA	Vector Laboratories	BK-1000
L17	Biotinilado Solanum tuberosum (papa) lectina	STL	Vector Laboratories	BK-3000
L18	Biotinilado Griffonia (Bandaeiraea) Simplicifolia me lectina	GSL I	Vector Laboratories	BK-2000
L19	Biotinilado Vicia villosa lectina	VVL	Vector Laboratories	BK-2000
L20	Biotinilado Lycopersicon esculentum (tomate) lectina	LEL	Vector Laboratories	BK-3000
L21	Ulex europaeus biotinilado aglutinina I	UEA I	Vector Laboratories	BK-1000
L22	Biotinilado jacalin	Jacalin	Vector Laboratories	BK-3000
A1	F cabra (ab ') 2 Fragmento de IgM anti-humano, el anticuerpo Fc5μ	IgM	Jackson Immuno Research	109-006-129
A2	Burro F (ab ') 2 Frag anti-IgG humana (H + L) untibody	AB1	Jackson Immuno Research	709-006-149
A3	Ratón anti-humano IgG F (ab ') 2 anticuerpo monoclonal	AB3	Jackson Immuno Research	209-005-097
A4	Cabra anti-humano alfa 2 macroglobulina anticuerpo policlonal	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	Conejo anti-humana de alfa-1-antitripsina anticuerpo policlonal	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Ratón anti-humano alfa-1-antitripsina anticuerpo monoclonal	A1AT	Sigma Aldrich	SAB4200198
A7	Conejo anti-humana de alfa-1-antitripsina anticuerpo policlonal	ACT	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	Conejo anti-humanaalfa-1-antiquimotripsina anticuerpo policlonal	ACT	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Ratón anti-transferrina humana anticuerpo monoclonal	La transferrina	GeneTex	GTX101035
A10	Conejo anti-transferrina humana anticuerpo policlonal	La transferrina	GeneTex	GTX77130
A11	Cabra anti-humano apolipoproteína J anticuerpo policlonal	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	Ratón anti-humano GP73 anticuerpo monoclonal	GP73	Abbott	14H4-23
A13	Ratón anti-humano GP73 anticuerpo monoclonal	GP73	Santa Cruz de Biotecnología INC	sc-101275
A14	Conejo anti-humana de alfa-1 fetoprotein anticuerpo policlonal	AFP	Genway	GWB-41C966
A15	Ratón anti-humano alfa-1-fetoproteína anticuerpo monoclonal	AFP	Fitzgerald	10-A05A
A16	Ratón anti-humano hemopexina anticuerpo monoclonal	Hemopexin	Assaypro	60190-05011
A17	Ratón anti-humano glipicano-3 (1G12) del anticuerpo monoclonal	GPL3	Santa Cruz Bio	sc-65443
A18	Ratón anti-humano Quininógeno (BPM) del anticuerpo monoclonal	Quininógeno	Assaypro	20333-05011
A19	Conejo anti-humano MMP-21 anticuerpo monoclonal	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Ratón anti-humano CEACAM-1 anticuerpos monoclonalesy	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
A21	Rata anti-humano DPPIV/CD26 anticuerpo monoclonal	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Ratón anti-humano PIVKA II anticuerpo monoclonal	PIVICA	Crystal química	8040
A23	Mouse anti-antígeno carcinoembrionario	CEA	EE.UU. biológica	C1300
A24	Mouse anti-cáncer de antígeno CA125	CA125	EE.UU. biológica	C0050-01D
A25	Mouse anti-CA19-9 del cáncer de antígeno	CA19-9	EE.UU. biológica	C0075-18
A26	Ratón anti-Lewis x anticuerpo monoclonal	Lewis X	Calbiochem	434631
bio	Biotinilada BSA (control positivo)	Bio	Hecho en casa	N / A

Nombre de los equipos o el reactivo s	Empresa	Número de catálogo
Microarrayer sin contacto	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 microplaca	Pescador	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultrafino de nitrocelulosa Coate microarrays se desliza	Gentel	TRAYECTORIA
Slide Imprinter (opcional)	La Compañía de gel	WSP60-1
Shaker	Pescador	15-453-211
Centrifugar	Eppendorf	5804 000.013
Deslice el lavabo / Slide tinción Plato con bastidor extraíble	Pescador	08-812
La incubación de diapositivas de cámara / caja portaobjetos del microscopio	Pescador	03-448-5
Brij 35, 30 w / v% en agua	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20 al	Pescador	P337-100
Peryodato de sodio (NaIO 4)	Sigma	311448
L-glutámico ácido γ-hidrazida	Sigma	G-7257
Acetato de sodio anhidro (CH3COONa)	Sigma	S2889
Albúmina de Suero Bovino (BSA)	Lampire Biológica Labs	7500804
Tampón fosfato salino (PBS) (10 veces)	Denville Científico	CP4390-48
DyLight 549 neutravidin conjugado	Thermo	22837
Inhibidor de la proteasa cóctel comprimidos	Roche	4693159001
ChromPure IgG humana, fragmento Fc	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure IgG humana, toda la molécula	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure IgG de ratón, toda la molécula	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure IgG de ratón, fragmento Fc	Jackson Immunoresearch	015-000-008
ChromPure IgG de conejo, molécula entera	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure burro IgG, molécula entera	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Microarray Scanner	Tecan	LS Reloaded