La diferenciación eficiente de las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras

Resumen

Hemos desarrollado un nuevo protocolo para mejorar la eficiencia de la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras. Las células madre embrionarias diferenciadas adquirida cuenta con las neuronas motoras como lo demuestra la expresión de marcadores neuronales de neuronas y el motor mediante técnicas de inmunohistoquímica.

Resumen

La diferenciación directa de las madre embrionarias (ES) las células en las neuronas motoras funcionales representa un recurso promisorio para estudiar mecanismos de la enfermedad, para examinar los nuevos compuestos de drogas, y para desarrollar nuevas terapias para enfermedades de las neuronas motoras como la atrofia muscular espinal (SMA) y la esclerosis lateral amiotrófica ( ALS). Muchos protocolos actuales utilizan una combinación de ácido retinoico (RA) y Sonic hedgehog (Shh) para diferenciar madre embrionarias de ratón (ES) de las células en las neuronas motoras ^1-4. Sin embargo, la eficacia de la diferenciación de las células en las neuronas motoras TEr sólo ha tenido un éxito moderado. Hemos desarrollado un protocolo de diferenciación de dos pasos ⁵ que mejora significativamente la eficiencia diferenciación en comparación con los protocolos establecidos actualmente. El primer paso consiste en mejorar el proceso de neuralization añadiendo Noggin y factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Noggin es una proteína morfogenética ósea (BMP) antagonista y está implicada en la inducción neural unae acuerdo con el modelo por defecto de la neurogénesis y los resultados en la formación de patrones neural anterior ^6. FGF señalización actúa sinérgicamente con Noggin en la inducción de la formación de tejido neuronal mediante la promoción de una identidad neuronal posterior ^7-9. En este paso, las células fueron TEr imprimado con Noggin, bFGF, y FGF 8-durante dos días para promover la diferenciación hacia linajes neuronales. El segundo paso es inducir motor especificación neurona. Noggin / FGF expuestas las células fueron incubadas con TEr RA y un agonista de Shh, agonista Smoothened (SAG), por otros 5 días para facilitar la generación de neuronas del motor. Para controlar la diferenciación de ETM en neuronas motoras, se utilizó una línea de células ES derivan de un eGFP ratón transgénico que expresa bajo el control del promotor de la neurona motora específica HB9 ^1. El uso de este protocolo completo, hemos logrado 51 ± 0,8% de la eficiencia de la diferenciación (n = 3, p <0,01, t de Student-test) ^5. Los resultados de inmunofluorescenciatinción mostró que las buenas prácticas agrarias + células expresan los marcadores de la neurona motora específicos, Islet-1 y la colina acetiltransferasa (CAT). Nuestro protocolo de dos pasos de diferenciación proporciona una solución eficiente para diferenciar células TEr en neuronas motoras espinales.

Protocolo

1. Paso 1: madre embrionarias de ratón (ES) de cultivo celular (Tiempo: 3 días)

1. Revestimiento fibroblastos primarios de embriones de ratón (PMEF)

1. Cubra cuatro platos de 100 mm de cultivo de tejidos con la gelatina para la adhesión PMEF. Añadir 8 ml de solución al 0,1% de gelatina (StemCell Technologies) a cada placa y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
2. Eliminar el exceso de gelatina a partir de los platos. No enjuague los platos.
3. Diluir un vial de mitomicina C inactivado PMEF (Millipore) que contiene aprox. 5 x 10 ⁶ células en 40 ml de PMEF los medios de comunicación (ver la receta e....

Discusión

La calidad de las células MES es el parámetro más crítico para la generación eficiente de las neuronas motoras. TEr células deben ser cultivadas en PMEF para impedir la diferenciación espontánea. Además de LIF ayuda a mantener las células MES en un estado indiferenciado. Mientras que las células se dividen cada TEr h 12-15, el medio de cultivo se agota rápidamente y debe ser reemplazado a diario.

Activación eficaz de la vía de Shh es un parámetro crítico necesario para inducir la especificac.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	La concentración final
PMEF	Millipore	PMEF-H	NA
PMEF medio
DMEM	Invitrogen	11965-118	NA
FBS	Invitrogen	16140-071	10%
L-glutamina	Invitrogen	25030-081	1%
La penicilina / estreptomicina	Invitrogen	15240-063	1%
MES medio
DMEM	StemCell Tecnologías	36250	NA
ES Cell-calificado de SFB	Invitrogen	16141-079	15%
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	1%
No aminoácidos esenciales	Invitrogen	11140-050	1%
Nucleósidos	Millipore	ES-008-D	1%
β-mercaptoetanol	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
La penicilina / estreptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
LIF	Millipore	LIF2010	10 ng / ml
Medio de diferenciación neuronal
DMEM	StemCell Tecnologías	36250	NA
ES Culto de SFB	StemCell Tecnologías	06905	15%
No aminoácidos esenciales	Invitrogen	11140-050	1%
Mono-tio glicerol	Sigma-Aldrich	M-6145	1 mM
Vaso	Invitrogen	PHC1506	50 ng / ml
FGF-8	Invitrogen	PHG0274	20 ng / ml
bFGF	Invitrogen	PHG0024	20 ng / ml
MND medio (diferenciación)
ES-Cult Medio-A basal	StemCell Tecnologías	5801	NA
Golpe de gracia de suero de reemplazo	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 suplemento	Invitrogen	17502-048	1%
Suplemento SU-B	StemCell Tecnologías	07155	1%
El ácido ascórbico	StemCell Tecnologías	07157	1%
La penicilina / estreptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G-8270	0,15% en d 2 H 2 O
La fibronectina	StemCell Tecnologías	07159	5 g / ml
La heparina	Sigma-Aldrich	H3149	20 ug / ml en D 2 H 2 O
β-mercaptoetanol	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
El ácido retinoico	Sigma-Aldrich	R-2625	1 mM
SAG	Merck Chemicals	566660	1 mM
MND medio (la cultura de la Neurona Motora)
ES-Cult Medio-A basal	StemCell Tecnologías	5801	NA
Golpe de gracia de suero de reemplazo	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 suplemento	Invitrogen	17502-048	1%
Suplemento SU-B	StemCell Tecnologías	07155	1%
El ácido ascórbico	StemCell Tecnologías	07157	1%
La penicilina / estreptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G-8270	0,15% en d 2 H 2 O
La fibronectina	StemCTecnologías de ell	07159	5 g / ml
La heparina	Sigma-Aldrich	H3149	20 ug / ml en D 2 H 2 O
β-mercaptoetanol	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
BDNF	R & D Systems	248-BD-005/CF	10 ng / ml
CNTF	R & D Systems	257-NY-010/CF	10 ng / ml
GDNF	R & D Systems	212-GD-010/CF	10 ng / ml
NT-3	R & D Systems	267-N3-005/CF	10 ng / ml

NA = no aplicable.

Tabla 1. PMEF y Medios de Comunicación para el cultivo celular o la diferenciación MES.

del reactivo	Empresa	Número de catálogo	La concentración final
0,1% de gelatina	StemCell Tecnologías	07903	NA
Poli-DL-ornitina	Sigma-Aldrich	P0421	0,1 mg / ml en D 2 H 2 O
Laminina de ratón	Millipore	CC095	2 g / ml en PBS
0,25% de tripsina / EDTA	StemCell Tecnologías	07901	NA
Accumax	Millipore	SCR006	NA

NA = no aplicable.

Tabla 2. Reactivos para revestimiento y la disociación.