La diferenciación eficiente de las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras

Summary

Hemos desarrollado un nuevo protocolo para mejorar la eficiencia de la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras. Las células madre embrionarias diferenciadas adquirida cuenta con las neuronas motoras como lo demuestra la expresión de marcadores neuronales de neuronas y el motor mediante técnicas de inmunohistoquímica.

Abstract

La diferenciación directa de las madre embrionarias (ES) las células en las neuronas motoras funcionales representa un recurso promisorio para estudiar mecanismos de la enfermedad, para examinar los nuevos compuestos de drogas, y para desarrollar nuevas terapias para enfermedades de las neuronas motoras como la atrofia muscular espinal (SMA) y la esclerosis lateral amiotrófica ( ALS). Muchos protocolos actuales utilizan una combinación de ácido retinoico (RA) y Sonic hedgehog (Shh) para diferenciar madre embrionarias de ratón (ES) de las células en las neuronas motoras ^1-4. Sin embargo, la eficacia de la diferenciación de las células en las neuronas motoras TEr sólo ha tenido un éxito moderado. Hemos desarrollado un protocolo de diferenciación de dos pasos ⁵ que mejora significativamente la eficiencia diferenciación en comparación con los protocolos establecidos actualmente. El primer paso consiste en mejorar el proceso de neuralization añadiendo Noggin y factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Noggin es una proteína morfogenética ósea (BMP) antagonista y está implicada en la inducción neural unae acuerdo con el modelo por defecto de la neurogénesis y los resultados en la formación de patrones neural anterior ^6. FGF señalización actúa sinérgicamente con Noggin en la inducción de la formación de tejido neuronal mediante la promoción de una identidad neuronal posterior ^7-9. En este paso, las células fueron TEr imprimado con Noggin, bFGF, y FGF 8-durante dos días para promover la diferenciación hacia linajes neuronales. El segundo paso es inducir motor especificación neurona. Noggin / FGF expuestas las células fueron incubadas con TEr RA y un agonista de Shh, agonista Smoothened (SAG), por otros 5 días para facilitar la generación de neuronas del motor. Para controlar la diferenciación de ETM en neuronas motoras, se utilizó una línea de células ES derivan de un eGFP ratón transgénico que expresa bajo el control del promotor de la neurona motora específica HB9 ^1. El uso de este protocolo completo, hemos logrado 51 ± 0,8% de la eficiencia de la diferenciación (n = 3, p <0,01, t de Student-test) ^5. Los resultados de inmunofluorescenciatinción mostró que las buenas prácticas agrarias + células expresan los marcadores de la neurona motora específicos, Islet-1 y la colina acetiltransferasa (CAT). Nuestro protocolo de dos pasos de diferenciación proporciona una solución eficiente para diferenciar células TEr en neuronas motoras espinales.

Protocol

1. Paso 1: madre embrionarias de ratón (ES) de cultivo celular (Tiempo: 3 días)

1. Revestimiento fibroblastos primarios de embriones de ratón (PMEF)

1. Cubra cuatro platos de 100 mm de cultivo de tejidos con la gelatina para la adhesión PMEF. Añadir 8 ml de solución al 0,1% de gelatina (StemCell Technologies) a cada placa y se incuba durante 30 min a temperatura ambiente.
2. Eliminar el exceso de gelatina a partir de los platos. No enjuague los platos.
3. Diluir un vial de mitomicina C inactivado PMEF (Millipore) que contiene aprox. 5 x 10 ⁶ células en 40 ml de PMEF los medios de comunicación (ver la receta en la Tabla 1) y la placa en cuatro de 100 mm placas de cultivo de tejidos. El PMEF proporcionar una capa alimentadora de células TEr.
4. PMEF deben ser cultivadas por lo menos un día antes de la adición de cultivos celulares TEr. PMEF se puede utilizar hasta 1 semana después de placas.

2. Revestimiento TEr células

Para controlar la eficacia de la diferenciación celular en neuronas motoras MES, Hemos utilizado HBG3, una línea de células ES derivada de un ratón transgénico que expresa EGFP bajo el control del promotor de la neurona motora específica HB9.

1. Descongelar un vial de células HBG3 MES (aprox. 1 x 10 ^7, aportados por el doctor Douglas Kerr, la Universidad Johns Hopkins) en un baño de agua 37 ° C. Añadir 5 ml de los medios de comunicación ES (ver la receta en la Tabla 1) en un tubo de 15 ml y centrifugar las células a 800 rpm durante 5 min.
2. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células MES en 20 ml de medio ES con recién añadido factor inhibidor de leucemia (LIF) a una concentración final de 10 ng / ml. Nota: L hay que añadir el día de su uso y es necesario para mantener las células MES en un estado indiferenciado.
3. Retire los medios de comunicación de 10 ml de la PMEF PMEF en cada plato y añadir 10 ml de la suspensión de células ES HBG3 a cada plato.
4. 24 h después de la siembra, las células TEr formar pequeñas colonias, similar en tamaño a la colonia indicada por la flecha en la Figura 1B. 72 horas después de placas, colonizaciónaumento es de tamaño, muchos siendo aproximadamente 100 micras de diámetro (Figura 1B, indicado por las flechas). Estas células están listas para la diferenciación. Los medios han de ser reemplazado a diario para mantener la proliferación de las células.

2. Paso 2: Inducción neural (Tiempo: 2 días)

Para inducir la diferenciación de las células TEr en neuronas motoras, las células TEr necesita ser separado de PMEF y se cultivaron en un medio ambiente de la suspensión. Gelatina matraces revestidos se utiliza para separar PMEF a partir de células TEr.

1. Cuando las colonias TEr están listos para la inducción neural (definido como día diferenciación 0), la capa 2 T150 matraces con 0,1% de gelatina (18 ml / matraz) durante 30 min a temperatura ambiente y después eliminar el exceso de gelatina y se lava con PBS 1x tres veces. NOTA: Cada cultura plato de 100 mm se necesita un frasco de gelatina T150-revestido para separar PMEF.
2. Retire con cuidado los medios de comunicación por aspiración, teniendo cuidado de no desalojar a colonias poco adheridas. Añadir 10 ml de PBS brevemente y luego eliminar por aspiración de completar el paso de lavado.
3. Para separar las células MEs de PMEF, añadir 0,25% de tripsina / EDTA (3 ml / placa, StemCell Technologies) e incubar durante 3-5 min a 37 ° C hasta que las células madre y PMEF desprenderse de la placa. Añadir 15 ml de medio fresco sin ES LIF y las células de la pipeta hacia arriba y abajo para romper las colonias (alrededor de 15-20 veces). A continuación, añadir a un 0,1% de gelatina recubierto T150 matraz y se incuba durante 30 min a 37 ° C. Después de la incubación, PMEF debe adjuntar a la superficie gelatinizada, mientras que las células madre embrionarias deben estar flotando. Recoger las células flotantes TEr en un tubo de 50 ml.
4. Girar hacia abajo a 800 rpm y Resuspender las células en 10 ml de medio de diferenciación neuronal (ver la receta en la Tabla 1).
5. Cuenta las células utilizando un hemocitómetro y luego placa aproximadamente 2 x 10 ⁶ células TEr en una placa de cultivo de 100-mm bacteriana o suspensión. Estas placas permiten el crecimiento de los cultivos en suspensión y promover la formación de cuerpos embrionarios (EBS).
6. En diferenciaciónción día 1, las células TEr formar pequeños agregados flotantes (EBS) que son visibles bajo un microscopio de luz. Cualquier prórroga PMEF conectar a la antena. Transferir las células y los medios de suspensión en un tubo de 15 ml y se centrifuga a baja velocidad (500 rpm) durante 3 min. Aspirar los medios de comunicación con cuidado, añadir 10 ml de medio fresco a la diferenciación neural pellets EBS, y luego las células de la placa bacteriana en un plato nuevo. Además de la reposición de los medios de comunicación, este paso se elimina la PMEF que llevan desde el paso anterior.
7. En el día diferenciación 2, EBS están listos para ser inducida en neuronas motoras.

3. Paso 3: Especificación de la Neurona Motora (Tiempo: 5 días)

1. En el día de la diferenciación 2, agitar la placa de cultivo y transferencia de los medios de comunicación y EBS en un tubo de 15 ml. Vamos EBs asentarse por gravedad (~ 10 minutos) o por centrifugación a baja velocidad (500 rpm) durante 3 min.
2. Aspirar el medio de cuidado y EBS volver a suspender en 10 ml de diferenciación de las neuronas del motor (MND) medio (ver receta en el
3. El día 7 de diferenciación, EBS debe ser aproximadamente de 150 a 200 micras de diámetro y debe expresar fuertes señales de buenas prácticas agrarias (Figura 1C). Estos EBS están listos para ser disociado y chapada en poly-DL-ornithine/laminin placas revestidas o cubreobjetos.

4. Paso 4: Preparación de Poly-DL-ornithine/laminin cubreobjetos recubiertos (Tiempo: 2 días)

Dos días antes de la disociación EBS (es decir, el día de la diferenciación de 5), preparar cubreobjetos poly-DL-ornithine/laminin-coated.

1. Colocar 12-mm redondas cubreobjetos (Warner Instruments) en la parte inferior de una placa de 24 pocillos. Disolver 25 mg de poli-DL-ornitina (Sigma-Aldrich) en 25 ml de agua estéril, doble destilada (d ₂ H ₂ O) para obtener una solución madre de 10 veces (1 mg / ml). Cuando esté listo para usar, realizar una dilución a 1/10 de poli-DL-ornitina con d ₂ H ₂ O para obtener concentración de 100 g / ml. Añadir 0,5 ml a cada pocillo de la placa de 24 pocillos y se incuba a 4 ° C durante la noche.
2. El día siguiente (día diferenciación 6), aspirado poli-DL-ornitina y dejar que las placas de cubierta y de aire seco se desliza en una campana de cultivo de tejidos. Lavar los pocillos de la placa con el d ₂ H ₂ O tres veces. Deje secar al aire durante una hora.
3. Disolver 1 mg laminina de ratón (Millipore) en 5 ml de helado-frío 1X PBS para hacer solución madre 100x (200 ug / ml). Cuando esté listo para utilizar, crear dilución 1/100 en el helado frío PBS 1X (2 mg de laminina / ml). Añadir 0,5 ml / pocillo en una placa de 24 pocillos y se incuban en 4 ° C durante la noche. Antes de las células de siembra, laminina exceso debe ser eliminado y pozos enjuagó con 1X PBS dos veces. Los cubreobjetos se pueden almacenar en DMN medio (0,5 ml / pocillo).

5. Paso 5: Alargamiento AXON (Tiempo: 2 días)

1. En el día 7 diferenciación, recoger EBs en un tubo de 15 ml y permitir EBS para asentarse (aproximadamente 3 minutos). Aspirar medios de comunicación y de re-suspender EBs en PBS. Permitir EBs se asiente y luego aspirar el PBS. Repita este paso 3 veces. Añadir 1 ml de Accumax (Millipore) para el EBS, mezclar suavemente y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, aspirar el exceso de Accumax que cubre el EBS.
2. Para disociar EBS, añadir 3 ml de medio de MND. Pipetas arriba y hacia abajo 20 veces usando una micropipeta Eppendorf de 1 ml (punta azul) para interrumpir EBS. Incubar durante 2 minutos a temperatura ambiente. Transferir la suspensión celular a un tubo de 12x75 mm con células colador tapa (BD Falcon) para obtener una suspensión de células individuales. Repita este paso disociación con el resto de grupos y células retenidas por el filtro con el fin de enriquecer el rendimiento de las células individuales. La suspensión final de células solo será de 6 ml.
3. Mezclar suavemente esta suspensión de células individuales y contar las células utilizando un hemocitómetro. Diluir las células en medio DMN (suplementado con 10 ng / ml de cada BDNF, GDNF, CNTF, y NT-3) a una densidad de 2x10 ⁵ células por ml. Añadir suspensión celular (0,5 ml / pocillo) a placas de 24 pocillos que contienen POly-DL-ornithine/laminin recubiertos cubreobjetos (previamente preparado como se ha descrito anteriormente). Las células diferenciadas se extienden neuritas largas después de 2 días de cultivo (Figura 1D).

6. Los resultados representativos

La Figura 1A muestra un esquema del protocolo. En el paso 1, las células se cultivan en TEr PMEF y suplementado con LIF para impedir la diferenciación espontánea. En general, no diferenciadas colonias TEr son redondos y compactos, y han definido claramente los bordes. Las colonias no están en contacto uno con el otro. Típicamente, las células TEr debe ser dividido en una proporción de 1:4 cada 2 ~ 3 días. Sin embargo, cada línea celular individual crecerá a un ritmo diferente y la relación de separación debe ser determinado empíricamente. Las flechas en la Figura 1B indican el aspecto típico de las células TEr después de cultivar en una capa alimentadora PMEF durante 3 días. Estas colonias son grandes (50-100 micras de diámetro), pero todavía mantienen borde redondo y definidos. En esta etapa las colonias están listos para la diferenciación o subcultivo. Una punta de flecha en la Figura 1B muestra una pequeña colonia MES que se encuentran típicamente 24 h después de placas. Cuatro días después de placas, las células TEr sido cubierto. Ellos muestran una apariencia aplastada y la pérdida de límites definidos, lo que indica que están empezando a diferenciarse. Tales células no son óptimas para la diferenciación en las células neuronales.

Para diferenciar las células TEr en neuronas motoras, las células TEr necesitan ser cultivados en condiciones de suspensión para permitir la formación de EB. En el paso 2, las células ES se transfieren a una superficie de cultivo sin una capa alimentadora para promover la formación de EB. En este paso, se incuban en un medio suplementado con diferenciación neuronal Noggin, bFGF, y FGF 8-durante 2 días a las células directos a un linaje neural. Pequeñas EBs puede observarse bajo el microscopio en el día 1 de diferenciación. Deben estar flotando en el medio. Prórroga PMEF también se puede encontrar en el día 1de la diferenciación y debe ser eliminado. Estas células se adhieren a los platos de bacterias que se eliminan cuando se EBs se pasan a un plato bacteriana nuevo. Así, por día 2 de diferenciación, PMEF pocas o ninguna debe ser visto en la placa de cultivo. En el paso 3, continuación de la transferencia de EBS para nuevos platos debe asegurar la eliminación de cualquier PMEF restante. EBS se cultivan en las neuronas motoras (MND diferenciación) los medios suplementados con AR y SAG por 5 días para diferenciar las células en las neuronas motoras. Durante el cultivo, EBS continuará creciendo en tamaño y se puede ver a simple vista en el día de diferenciación 3 ~ 4. Figura 1C muestra el aspecto microscópico de EBS en día la diferenciación 7. A diferencia de las células no diferenciadas, EBS muestran una fuerte fluorescencia debido a la expresión de GFP. Estos EBs son óptimamente diferenciados y están listos para la disociación. La citometría de flujo mostró que el 51% ± 0,8% de las células de la disociada EBs se habían diferenciado en células que expresan GFP ^5. En el paso 5, la cultura de THESE neuronas motoras en la presencia de GDNF, CNTF, el BDNF y NT3 resultados en la extensión de las proyecciones a largo axonal. Figura 1D muestra la apariencia de las células diferenciadas 2 días después de placas de disociarse EBS. Tenga en cuenta neuritas largas que se extienden desde los cuerpos celulares de las células cultivadas en placas. Tinción inmunofluorescente demuestra que las células GFP + expresan el marcador pan-neuronal (neurofilamentos-cadena media) y dos marcadores de motor neurona específica, (Islet-1 y colina acetiltransferasa, Figura 2).

Figura 1. La diferenciación de las células TEr en las neuronas motoras (imagen modificada de Wu et al. ^5). A) Esquema del protocolo de diferenciación de las células TEr a las neuronas motoras. B) las células no diferenciadas TEr forman colonias redondas en la parte superior de una capa alimentadora de fibroblastos. Tienen la expresión de GFP débil. C) Las células TEr fueron separados de las capas de alimentación y de culde color rojo en los platos de sujeción de baja para formar EBS. Durante los dos primeros días del proceso de diferenciación, las células fueron expuestas a 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml de bFGF, y 20 ng / ml de FGF-8. Posteriormente, fueron inducidas a diferenciarse con 1 mM de ácido retinoico y 1 mM de Sonic hedgehog SAG agonista durante 5 días. Células diferenciadas TEr expresó fluorescencia de GFP fuerte. D) Después de la diferenciación de 7 días, EBS se disocian y se colocaron en placas recubiertas poly-DL-ornithine/laminin. Las células diferenciadas extiende largos procesos neuronales después de 2 días de cultivo. Barras de escala = 200 micras. MN = de la neurona motora. B, C y D son imágenes brillantes sobre el terreno y B ', C' y D 'son las imágenes de fluorescencia correspondientes.

Figura 2. Caracterización de las neuronas motoras TEr derivadas de células. La tinción de inmunofluorescencia para la cadena de neurofilamentos medio (NF-M, de color rojo), chat (rojo), y el Islote de 1 (rojo) fue coincidente con las buenas prácticas agrarias (verde) expresión. DAPI (azul) se utilizó para identificar los núcleos. Barras de escala = 50 micras.

Discussion

La calidad de las células MES es el parámetro más crítico para la generación eficiente de las neuronas motoras. TEr células deben ser cultivadas en PMEF para impedir la diferenciación espontánea. Además de LIF ayuda a mantener las células MES en un estado indiferenciado. Mientras que las células se dividen cada TEr h 12-15, el medio de cultivo se agota rápidamente y debe ser reemplazado a diario.

Activación eficaz de la vía de Shh es un parámetro crítico necesario para inducir la especificac...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	La concentración final
PMEF	Millipore	PMEF-H	NA
PMEF medio
DMEM	Invitrogen	11965-118	NA
FBS	Invitrogen	16140-071	10%
L-glutamina	Invitrogen	25030-081	1%
La penicilina / estreptomicina	Invitrogen	15240-063	1%
MES medio
DMEM	StemCell Tecnologías	36250	NA
ES Cell-calificado de SFB	Invitrogen	16141-079	15%
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	1%
No aminoácidos esenciales	Invitrogen	11140-050	1%
Nucleósidos	Millipore	ES-008-D	1%
β-mercaptoetanol	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
La penicilina / estreptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
LIF	Millipore	LIF2010	10 ng / ml
Medio de diferenciación neuronal
DMEM	StemCell Tecnologías	36250	NA
ES Culto de SFB	StemCell Tecnologías	06905	15%
No aminoácidos esenciales	Invitrogen	11140-050	1%
Mono-tio glicerol	Sigma-Aldrich	M-6145	1 mM
Vaso	Invitrogen	PHC1506	50 ng / ml
FGF-8	Invitrogen	PHG0274	20 ng / ml
bFGF	Invitrogen	PHG0024	20 ng / ml
MND medio (diferenciación)
ES-Cult Medio-A basal	StemCell Tecnologías	5801	NA
Golpe de gracia de suero de reemplazo	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 suplemento	Invitrogen	17502-048	1%
Suplemento SU-B	StemCell Tecnologías	07155	1%
El ácido ascórbico	StemCell Tecnologías	07157	1%
La penicilina / estreptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G-8270	0,15% en d 2 H 2 O
La fibronectina	StemCell Tecnologías	07159	5 g / ml
La heparina	Sigma-Aldrich	H3149	20 ug / ml en D 2 H 2 O
β-mercaptoetanol	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
El ácido retinoico	Sigma-Aldrich	R-2625	1 mM
SAG	Merck Chemicals	566660	1 mM
MND medio (la cultura de la Neurona Motora)
ES-Cult Medio-A basal	StemCell Tecnologías	5801	NA
Golpe de gracia de suero de reemplazo	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 suplemento	Invitrogen	17502-048	1%
Suplemento SU-B	StemCell Tecnologías	07155	1%
El ácido ascórbico	StemCell Tecnologías	07157	1%
La penicilina / estreptomicina	Millipore	TMS-AB2-C	1%
Glutamax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucosa	Sigma-Aldrich	G-8270	0,15% en d 2 H 2 O
La fibronectina	StemCTecnologías de ell	07159	5 g / ml
La heparina	Sigma-Aldrich	H3149	20 ug / ml en D 2 H 2 O
β-mercaptoetanol	Millipore	ES-007-E	0,1 mM
BDNF	R & D Systems	248-BD-005/CF	10 ng / ml
CNTF	R & D Systems	257-NY-010/CF	10 ng / ml
GDNF	R & D Systems	212-GD-010/CF	10 ng / ml
NT-3	R & D Systems	267-N3-005/CF	10 ng / ml

del reactivo	Empresa	Número de catálogo	La concentración final
0,1% de gelatina	StemCell Tecnologías	07903	NA
Poli-DL-ornitina	Sigma-Aldrich	P0421	0,1 mg / ml en D 2 H 2 O
Laminina de ratón	Millipore	CC095	2 g / ml en PBS
0,25% de tripsina / EDTA	StemCell Tecnologías	07901	NA
Accumax	Millipore	SCR006	NA