Medición de actividad de factor V en el plasma humano usando un ensayo de coagulación de microplacas

Summary

Este estudio describe un ensayo en microplaca novela que mide la actividad FV coagulación durante la formación del coágulo de fibrina en el plasma humano que no se ha informado anteriormente. El método utiliza un lector de microplacas cinético para medir continuamente el cambio en la absorbancia a 405 nm durante la formación del coágulo de fibrina en plasma humano.

Abstract

En respuesta a una lesión, la coagulación sanguínea se activa y da como resultado la generación de la proteasa de la coagulación, la trombina. La trombina escinde el fibrinógeno en fibrina, que forma un coágulo insoluble que detiene la hemorragia. Factor V (FV) en su forma activada, FVa, es un cofactor esencial para la proteasa FXa y acelerador de la generación de trombina durante la formación del coágulo de fibrina como parte de protrombinasa ^{1, 2.} Manual de ensayos de FV se han descrito ^{3, 4,} pero consumen mucho tiempo y subjetivo. Automatizados ensayos de FV se han reportado ^5-7, pero el analizador y los reactivos son caros y generalmente proporcionan sólo el tiempo de coagulación no, la velocidad y extensión de la formación de fibrina. La plataforma microplaca se prefiere para medir catalizadas por enzimas eventos por conveniencia, tiempo, coste, de pequeño volumen, la supervisión continua, y de alto rendimiento de ^{8, 9.} Ensayos de microplacas han sido reportados para la lisis del coágulo ^10, la agregación plaquetaria11, ¹² y factores de coagulación, pero no para la actividad de FV en el plasma humano. El objetivo del método era el de desarrollar una microplaca de ensayo que mide la actividad FV durante la formación de fibrina en el plasma humano.

Este método de microplaca novela describe un ensayo simple, barata y rápida de la actividad FV en el plasma humano. El ensayo utiliza un lector de microplacas cinético para controlar el cambio de absorbancia a 405 nm durante la formación de fibrina en el plasma humano (Figura 1) ^13. El ensayo mide de forma precisa el tiempo, la frecuencia inicial, y la extensión de la formación del coágulo de fibrina. Se requiere sólo cantidades mu l de plasma, se completa en 6 min, tiene alto rendimiento, es sensible a la 24-80pM FV, y mide la cantidad de involuntariamente activado (1-etapa de actividad) y la trombina activada por FV (Actividad 2-etapa ) para obtener una evaluación completa de su actividad funcional total (2-etapa de actividad - 1-etapa de actividad).

Intravascular diseminadacular diseminada (CID) es una coagulopatía adquirida que más a menudo se desarrolla a partir de infecciones preexistentes ^14. DIC se asocia con un mal pronóstico y la mortalidad aumenta por encima de la patología preexistente ^15. El ensayo se utilizó para demostrar que en 9 pacientes con coagulación intravascular diseminada, la FV 1-etapa, etapa 2, y las actividades totales se redujeron, en promedio, un 54%, 44%, y 42%, respectivamente, en comparación con humano normal agrupado plasma de referencia (NHP).

El ensayo de microplaca FV es fácilmente adaptable para medir la actividad de cualquier factor de coagulación. Este ensayo aumentará nuestra comprensión de la bioquímica FV a través de una medición más exacta y completa de su actividad en la investigación y la práctica clínica. Esta información tendrá un impacto positivo entornos sanitarios a través de un diagnóstico precoz y el desarrollo de tratamientos más eficaces para los trastornos de la coagulación, como el CID.

Protocol

1. Preparación de plasma deficiente en FV Humano

1. Este método es una modificación del procedimiento descrito originalmente por Bloom et al ^4.
2. Obtenga la sangre humana de un voluntario adulto que consiente saludable (Hombre o Mujer, Edad 18 - 50 años) que no está tomando ningún medicamento. Use guantes de látex y una bata de laboratorio durante todo el procedimiento.
3. Preparar 100 ml de 3,2% (w / v) de citrato trisódico en agua destilada. Cargar 6,0 ml de esta solución en 60 ml jeringas separadas. Eliminar el aire por el émbolo deprimente cuidadosamente hasta la marca de 6,0 ml en la jeringa.
4. Utilice un algodón con alcohol para limpiar el área de la vena cubital entre bíceps y el antebrazo. Conectar aparato mariposa de calibre 20 a una jeringa de 3 ml. Introduzca la aguja en la vena cubital mariposa y extraer suavemente el émbolo hasta que la sangre se llena hasta la marca de 3 ml. Deseche la jeringa con sangre. Este paso se realiza para eliminar cualquier factor tisular liberado del endotelio dañado en la agujalesión sitio que pueden activar el proceso de coagulación e interferir con la preparación de plasma deficiente en FV.
5. Conecte aguja mariposa 'cargada' con jeringa de 60 ml de citrato trisódico 6,0 ml y extraer suavemente el émbolo hasta que la sangre llegue a la marca de 60 ml en la jeringa. (10,9 mm La concentración final de citrato).
6. Retire la jeringa de la aguja de mariposa y mezclar suavemente la jeringa, manteniendo un dedo enguantado o el pulgar en la salida de la jeringa.
7. Continuar la extracción de sangre en 60 ml jeringas cada una con 6,0 ml de 3,2% de citrato trisódico como se ha descrito anteriormente. Uno debe anticipar la recuperación de aproximadamente 50% del volumen de sangre citratada como plasma después de la centrifugación y que 50 l de plasma deficiente en FV se requiere por muestra en el ensayo en microplaca. Nuestro laboratorio de rutina procesa 300-420 ml de sangre citratada a la vez con 5-7 x 60 ml jeringas cada uno con 6,0 ml de 3,2% de citrato trisódico / jeringa. Esto es suficiente FV plasma deficiente para aproximadamente 3.000 microlos ensayos de placa (ver más abajo).
8. Retire la aguja del brazo de mariposa voluntario y presione una gasa estéril sobre el sitio de punción de la vena durante 1,0 min. Cubra el sitio de la punción venosa con una venda estéril.
9. Centrifugar la sangre citratada a 3.300 xg durante 20 min a temperatura ambiente. Recuperar capa superior de plasma de color amarillo a un vaso de precipitados de plástico con una barra de agitación con una pipeta de transferencia de plástico teniendo cuidado de no perturbar la capa inferior de células de sangre roja y blanca.
10. Medir el volumen de plasma en ml y retener 100 l de plasma antes de la adición de EDTA en hielo durante el tiempo futuro coágulo de protrombina (PT) prueba (ver abajo).
11. Agregar lentamente sólido EDTA al plasma citratado con agitación suave a temperatura ambiente para lograr 5 mM (concentración final). Una vez que el EDTA se ha disuelto, ajustar el pH a 7,0 mediante la adición gota a gota de NaOH 1,0 M con agitación suave.
12. Cubra vaso con Saran Wrap y se incuba durante 8-10 h sin agitación a 37 º C.
13. Cada hora 2, se recuperan 100 l deel plasma tratado con EDTA en hielo y determinar la PT en el momento de la incubación con EDTA y comparar con el PT de plasma antes de la adición de EDTA (ver arriba).
14. Para las determinaciones del PT, 8 tiras removibles lugar immunomodule bien entrado sujeción del molde de plástico e insertar en un lector de microplacas.
15. Orient tiras immunomodule en un lector de microplacas como: vacío, la muestra vacía, vacía, vacía de la muestra, vacío, vacío y de izquierda a derecha en el soporte de plantilla para minimizar la interferencia dispersión de la luz de la vecina que contienen muestras tiras. Asimismo, el uso sólo pozos 2-7 de arriba a abajo en cada tira 8 immunomodule bien para minimizar la interferencia de dispersión de luz de los bordes de soporte de plantilla de plástico.
16. El ensayo de microplaca FV es capaz de medir la formación del coágulo de fibrina en al menos 12 muestras diferentes de forma simultánea (6 muestras por cada tira de immunomodule más de 2 tiras immunomodule).
17. Usando una pipeta multicanal, añadir 50 l de HBS (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) acada pocillo de microplaca para cada uno de muestra a ensayar. Usando una pipeta única, añadir 50 l de una mezcla de plasma humano normal de referencia (NHP) o plasma antes de la adición de EDTA o en diversos tiempos de incubación después de la adición de EDTA para separar pocillos de la microplaca.
18. Usando una pipeta multicanal, añadir 50 l de tromboplastina (Véase más abajo para método de preparación) a todos los pocillos de la microplaca con plasma a ensayar. Incubar en un lector de microplacas a 25 º C durante 1 min y el programa de lector de microplacas a agitar la placa durante el sec 15-25 min de incubación de la 1.
19. Utilizando el ordenador interconectado con el lector de microplacas, acceso SoftMax Pro software de aplicación de microplacas. Ajuste el lector de absorbancia, a 405 nm de longitud de onda, de modo a temperatura cinética, a 25 ° C, y el programa de lector de microplacas a agitar durante 5 segundos, y leer la absorbancia a 405 nm cada 5 s durante 6 min.
20. Usando una pipeta multicanal, se añade cloruro de calcio (50 l de 25 mM en agua destilada; 2.1mm finaconcentración l) a todos los pocillos de microplaca, espere 15 segundos y pulse la tecla "Inicio" icono en el menú de microplacas SoftMax Pro para comenzar el ensayo.
21. Determinar el PTS de los perfiles de absorbancia frente a tiempo en SoftMax Pro como el tiempo para alcanzar el máximo aumento medio en la absorbancia a 405 nm (El punto medio de la absorbancia frente a la curva sigmoidal tiempo producido después de tromboplastina y la adición de cloruro de calcio. Véase más adelante, Figura 1).
22. Cálculo de la FV 1-etapa de actividad de la sesión el tiempo de coagulación (seg) vs actividad del registro de FV (unidades / ml) como se ilustra a continuación en la Figura 2A. Para los propósitos de cuantificación, 1Unidad de actividad FV se define como la actividad presente en 1,0 ml NHP antes de la activación intencional con añadió trombina (Ver más adelante, los análisis de muestras de plasma humano con la FV 1-etapa y 2-etapa microplaca de ensayo de coagulación).
23. Preparar 4.0l de HEPES 20 mM que contiene NaCl 0,15 M en agua destilada con agitación suave. Ajustar el pH a 7,4 con dropw lentoise adición de NaOH 5,0 M (HBS, pH 7,4).
24. Obtener una longitud suficiente de tubos de diálisis y enjuague a fondo con agua destilada. Un nudo en un extremo de la tubería. Transferencia de plasma tratado con EDTA a tubos de diálisis con una pipeta de transferencia de plástico, retirar el aire, y ate un nudo en el otro extremo de la tubería.
25. Con cuidado, colgar el plasma tratado con EDTA en la tubería en la HBS con agitación suave. Cubrir con Saran Wrap y se dializa para 14-16h con agitación suave a 4 ° C.
26. Retire con cuidado el plasma EDTA-treated/dialyzed en 3,0 ml alícuotas de 15,0 ml tubos de tapón de rosca y retener 100 l para el ensayo de PT 'final' FV plasma deficiente en hielo. Almacenar el plasma deficiente en FV-a -80 ° C hasta su uso. En las condiciones descritas anteriormente, el aumento PTS de 10-15 seg antes de la adición de EDTA a 90-100 sec 8-10 h después de la adición de EDTA. El plasma deficiente en FV preparada por este método habitualmente contiene menos de 0,1% de la sustancia activa presente en el FV de partidaplasma humano fresco.

2. Preparación de tromboplastina

1. La diálisis es necesaria para eliminar cualquier calcio de este reactivo para permitir precisamente temporización formación del coágulo de fibrina desde el momento de la adición de cloruro de calcio para iniciar el proceso de coagulación.
2. Preparar 100 ml y 4.0L de HEPES 20 mM y NaCl 0,15 M en agua destilada en un vaso de precipitados de plástico con agitación suave. Ajustar el pH a 7,4 con la adición lenta gota a gota de NaOH 5,0 M (HBS, pH 7,4).
3. Añadir 6,0 ml de HBS, pH 7,4 a cada vial de reactivo de tromboplastina, coloque la tapa y agite suavemente hasta disolver. Incubar reactivo en viales tapados durante 15 minutos a temperatura ambiente para disolver el material se secó. Agitar suavemente hasta disolver completamente.
4. Cortar una longitud suficiente de tubos de diálisis, enjuague bien con agua destilada, y ata un extremo de la tubería con un nudo. Transferir a un tubo de diálisis de tromboplastina, eliminar el aire, y ata el otro extremo de la tubería con un nudo.
5. Californiarefully colgar tubo de diálisis en 4.0L de HBS, pH 7,4 y se agita suavemente cubierto con Saran Wrap a 4 º C durante 14-16 h.
6. Transferir 3,0 ml de alícuotas de la tromboplastina dializada a tubos de 15 ml de tapón roscado y se almacena a -80 ° C hasta su uso.

3. Preparación de 1-FV etapa de microplacas ensayos de coagulación curvas de actividad estándar

1. Descongelar plasma deficiente en FV, NHP, y tromboplastina a 37 ° C durante 10 min. Mezclar suavemente FV plasma deficiente y tromboplastina de forma independiente, para separar transferir cubetas de lavado de plástico, y se incuba en hielo. Guarde el NHP en hielo después mezclando suavemente. Tienda cloruro de calcio (25 mM en agua destilada) en una bandeja de lavado separado a temperatura ambiente.
2. Preparar 200 l cada uno de 2-veces diluciones seriadas de NHP de 0 -, 2 -, 4 -, 8 -, 16 -, 32 -, 64 -, 128 -, 256 -, 512-veces en HBS, pH 7,4 usando 1,5 ml tubos de microcentrífuga. Vortex pocillo e incubar en hielo.
3. Coloque las tiras removibles 8 immunomodule así en psoporte de plantilla lastic e insertar en un lector de microplacas.
4. Orient tiras immunomodule en un lector de microplacas como: vacío, la muestra vacía, vacía, vacía de la muestra, vacío, vacío y de izquierda a derecha en el soporte de plantilla para minimizar la interferencia dispersión de la luz de la vecina que contienen muestras tiras. Asimismo, el uso sólo pozos 2-7 de arriba a abajo en cada tira 8 immunomodule bien para minimizar la interferencia de dispersión de luz de los bordes de soporte de plantilla de plástico.
5. El ensayo de microplaca FV es capaz de medir la formación del coágulo de fibrina en al menos 12 muestras diferentes de forma simultánea (6 muestras por cada tira de immunomodule más de 2 tiras immunomodule).
6. Encienda el lector de microplacas y acceso SoftMax Pro software de aplicación de microplacas.
7. Usando una pipeta multicanal, hacer adiciones simultáneas de plasma deficiente en FV (50 l) a todos los pocillos de la microplaca de muestra. Utilizar una pipeta única, añadir 50 l de las diluciones en serie de 10 NHP preparados anteriormente para separar pocillos de la microplaca.
8. Usando una pipeta multicanal, añadir tromboplastina (50 l) a todos los pocillos de la muestra. Incubar en el lector de microplacas a 25 º C durante 1 min y el programa de lector de microplacas a agitar la placa durante el sec 15-25 min de incubación de la 1.
9. Utilizando el ordenador interconectado con el lector de microplacas, acceso SoftMax Pro software de aplicación de microplacas. Ajuste el lector de absorbancia, a 405 nm de longitud de onda, de modo a temperatura cinética, a 25 ° C, y el programa de lector de microplacas a agitar durante los primeros 5 segundos después de la adición de cloruro de calcio, y la absorbancia medida a 405 nm cada 5 s durante 6 min a partir de entonces. El intervalo de 5 segundos agitación no se incluye en los tiempos de coagulación calculado (ver a continuación).
10. Con una pipeta multicanal, añada cloruro de calcio (50 l de 25 mM en agua destilada, concentración final 3,5 mM) a todos los pocillos de la microplaca muestra, espere 15 segundos, pulse el botón "Inicio" icono de la aplicación en microplaca SoftMax Pro desde el ordenador para comenzar la ensayo.
11. Ttiempos de coagulación que se calcula como el tiempo en segundos para alcanzar el punto medio entre el mínimo y el máximo de absorbancia a 405 nm después de tromboplastina y la adición de cloruro de calcio.
12. Las velocidades iniciales de la formación del coágulo se calculan como la tasa de aumento de la absorbancia a 405 nm (mUnidades / min) que abarca el primero 5 puntos de tiempo de formación de coágulos en la porción lineal de la curva de absorbancia frente a tiempo.
13. La extensión de la formación del coágulo se calculó como la diferencia entre la absorbancia máxima y mínima a 405 nm (unidades) alcanzada durante el evento de formación de coágulos.

4. Análisis de muestras de plasma humano con la FV 1-etapa y dos etapas de ensayo de microplacas Coagulación

1. Descongelar plasma deficiente en FV, NHP, plasmas de muestra, y de tromboplastina a 37 ° C durante 10 min. Mezclar suavemente FV plasma deficiente y tromboplastina independientemente, transferir para separar plástico cubetas de lavado de ELISA, e incubar en hielo. Guarde los plasmas PHN y la muestra en hielodespués mezclando suavemente. Tienda cloruro de calcio (25 mM en agua destilada) en una bandeja de lavado separado de ELISA a temperatura ambiente.
2. Preparar 200 l cada una de 40-veces diluciones de plasmas NHP y muestra en HBS, pH 7,4 utilizando 1,5 ml tubos de microcentrífuga. Vortex pocillo e incubar en hielo.
3. Inserte 8 tiras removibles immunomodule así en el soporte de plástico plantilla e insertar en un lector de microplacas.
4. Suplente vacío, vacío, muestra, vacío, muestra vacía, vacía, vacía y tiras immunomodule de izquierda a derecha en el soporte de plantilla para minimizar la interferencia dispersión de la luz de la vecina que contienen muestras tiras. Usar sólo los pozos 2-7 de arriba a abajo en cada tira immunomodule para minimizar las interferencias de dispersión de luz de los bordes de soporte de plantilla de plástico.
5. Encienda el lector de microplacas y acceso SoftMax Pro software de aplicación de microplacas.
6. Usando una pipeta multicanal, añadir plasma deficiente en FV (50 l) a todos los pocillos de la microplaca de muestra. El uso de un single pipeta, añadir 50 l de 40-veces NHP diluida o plasmas muestra preparada anteriormente para separar pocillos de la microplaca.
7. Usando una pipeta multicanal, añadir tromboplastina (50 l) a todos los pocillos de la muestra. Incubar en el lector de microplacas a 25 º C durante 1 min y el programa de lector de microplacas a agitar la placa durante el sec 15-25 min de incubación de la 1.
8. Utilizando el ordenador interconectado con el lector de microplacas, acceso SoftMax Pro software de aplicación de microplacas. Ajuste el lector de absorbancia, a 405 nm de longitud de onda, de modo a temperatura cinética, a 25 ° C, y el programa de lector de microplacas a agitar durante los primeros 5 segundos después de la adición de cloruro de calcio, y la absorbancia medida a 405 nm cada 5 s durante 6 min a partir de entonces. El intervalo de 5 segundos agitación no se incluye en los tiempos de coagulación calculado (ver a continuación).
9. Usando una pipeta multicanal, se añade cloruro de calcio (50 l de 25 mM en agua destilada; concentración final 6,25 mm) para todas las muestras pocillos de la microplaca y pr inmediatamenteSEE "Inicio" icono de la aplicación en microplaca SoftMax Pro de la computadora para comenzar el ensayo.
10. Al final de la carrera, determinar el tiempo, la velocidad inicial, y el alcance de la formación de coágulos de 40-veces NHP diluido y plasmas de muestra a partir de los perfiles de absorbancia frente al tiempo en SoftMax Pro.
11. Teniendo en cuenta la dilución 40-veces, usar el tiempo de coagulación para cada muestra para calcular la actividad de FV en Unidades / ml de la FV 1-etapa curva de actividad estándar de tiempo de registro Clot vs actividad del registro de FV (figura 2A). Esto representa la actividad FV-1 etapa o que sin 'intencional' activación por la trombina.
12. Desde FV está activado con trombina para el cofactor activo, FVa ^1, un segundo ensayo después de la adición y la incubación con trombina es crítica para medir con precisión la FV 2-etapa de actividad de una muestra de plasma (con 'intencional' activación por trombina añadido).
13. Para la FV de 2 etapas de ensayo, preparar 200-300 l de trombina purificada a ¹⁸t 100 nM en HBS, pH 7,4 y se incuba en hielo. Planee el uso de 10 l de trombina diluida para cada muestra de plasma a ensayar con la FV 2-etapa de ensayo.
14. Diluir 120 l de la NHP arriba y plasmas de muestra de 40-veces a 100-veces con 170 l de HBS, pH 7,4 que contiene 2,8 mM de cloruro de calcio. Añadir 10 l de trombina (10 nM concentración final) a cada muestra. Vortex bien para mezclar e incubar a 37 ° C durante 1 min.
15. Diluir NHP y plasmas de muestra con 500-veces mediante la adición de 400 l de HBS, pH 7,4, así vórtice, y el ensayo de 50 l de cada muestra de plasma en la FV 1-etapa microplaca de ensayo como se describe anteriormente.
16. Determinar el tiempo de coagulación para NHP y cada muestra de plasma ensayadas a partir de los perfiles de absorbancia frente a tiempo en SoftMax Pro. Teniendo en cuenta la dilución de 500 veces, usar el tiempo de coagulación para cada muestra para calcular la FV 2-etapa de actividad de la FV 1-etapa estándar curva de tiempo de registro Clot vs actividad del registro de FV (figura 2A).
17. El total de actividades FVty entonces se puede calcular como FV 2-etapa de actividad - FV 1-etapa de actividad.

Results

Resultados representativos FV - Preparación de 1-etapa microplaca ensayos de coagulación curvas patrón de actividad

Un ejemplo representativo de la formación del coágulo de fibrina en el ensayo de FV en el tiempo generada por el lector de microplacas se ilustra en la figura 1. El ensayo de FV mide con precisión el tiempo, del tipo inicial, y el alcance de la formación del coágulo de fibrina. La inspección de los pozos sobre la terminación ensayo confirmó que se produjo la formación de coágulos. Todas las reacciones alcanzado aproximadamente el mismo grado de formación de coágulo con un cambio general en la absorbancia a 405 nm de 0,35 - 0,45 unidades entre la absorbancia de partida antes y después de la absorbancia máxima de tromboplastina y la adición de cloruro de calcio. Ejemplos representativos de FV 1-etapa de actividad normales curvas de tiempo de registro Clot (en segundos) vs actividad de registro FV (unidades / ml) y log velocidad inicial de formación de coágulos (en mUnidades / min) vs actividad de registro FV (Unidades / ml ) para diluciones en serie de NHP se muestra en la Figura 2B, respectivamente. Colocación del gráfico doble logarítmico de tiempo de coagulación vs FV 1-Actividad indicando una fuerte correlación entre estas variables tras el análisis de regresión lineal (Figura 2A, R ² = 0,980). Colocación del gráfico doble logarítmico de la velocidad inicial de formación de coágulos vs Actividad FV también se indica una fuerte relación entre estas variables tras el análisis de regresión lineal (Figura 2B, R ² = 0,983). La relación de ambos el tiempo de coagulación de registro y la velocidad inicial de formación de coágulos vs Activity Log FV se mantuvo lineal para NHP se diluye hasta 512 veces. Desde FV circula en NHP en aproximadamente 40 nM ^12-16, la microplaca de ensayo es sensible a unos 24-FV 80pM en NHP. Dado que la constante de la interacción de FVa-FXa-lípido en protrombinasa disociación es de aproximadamente 1 nM ^17, el ensayo de microplaca de FV es completamente adecuado para la medición de los niveles de FV en el fisiológicamente relevant rango nM para la función de FVa en protrombinasa.

Usando el ensayo de FV microplaca, también se determinó que el rango normal de la actividad de FV en el ensayo de actividad FV 1-etapa de 15 plasmas de control sanos (Masculino y Femenino, Edad 18-20yrs) fue (media ± desviación estándar, rango): 0,96 ± 0.14U/ml; 0.68-1.11U/ml. Esto concuerda bien con la actividad normal sano FV y la gama (0.66-1.14U/ml) informó por Cutler et al. para la FV 1-etapa de actividad determinado con un analizador automático ^7. La variabilidad intra-ensayo del tiempo, alcance y velocidad inicial de formación de coágulos en la FV 1-fase de ensayo en 6 pozos en 8 diferentes días fue del 3,4%, 4,4% y 3,1%, respectivamente. La variabilidad inter-ensayo del tiempo, la extensión y velocidad inicial de formación de coágulos en la FV 1-etapa ensayo en 6 pocillos de 8 experimentos diferentes en 8 días diferentes fue 7,1%, 7,8%, y 9,2%, respectivamente. Por lo tanto, la variabilidad intra-e inter-ensayo de estas tres medivariables de rojo estaba a un nivel bajo y aceptable para el rendimiento del ensayo robusto dentro y entre microplaca de ensayo de muestras múltiples simultáneamente (hasta 12).

Resultados representativos - Ensayo de muestras de plasma humano con la FV 1-etapa y dos etapas microplaca de ensayo de coagulación

La curva estándar de Clot registro del tiempo vs actividad del registro de FV (figura 2A) se utilizó para medir la actividad de FV en NHP y 9 plasmas de pacientes con CID que no fueron activados intencionalmente con adición de trombina (FV 1-etapa de actividad) o se activaron con intencionalmente añadió trombina (FV 2-etapa de actividad) y los resultados se muestran en la Tabla 1. Todos los plasmas 9 DIC paciente exhibió FV 1-etapa actividades y las tasas iniciales de la formación del coágulo que se disminuyeron en promedio, un 54% y 18%, respectivamente, de NHP. La extensión de la formación de coágulos en la FV 1-fase de ensayo en los pacientes con DIC no fueron muy diferentes de PHN, y aumentó, en promedio, en un 13% a partir de NHP.

La activación de trombina generada NHP con un aproximado de 8-veces mayor en FV 2-etapa de actividad por encima de la FV 1-etapa de actividad (Tabla 1). Esto indica que la FV en el PHN estaba presente principalmente en su forma inactivada y está de acuerdo con los resultados reportados previamente utilizando manuales tubo de inclinación ensayos FV ^{3, 4} y ensayos automatizados FV ^5-7. El FV 2-etapa y actividad total también disminuyó en los pacientes con CID, en promedio, un 44% y 42%, respectivamente, de NHP. Las tasas iniciales y grados de formación de coágulos en la FV 2-etapa de ensayo en los pacientes con CID no fueron significativamente diferentes de NHP, y varía en promedio, en aproximadamente 9% y 4%, respectivamente, de la observada con NHP. Estos resultados indican que, en comparación con la FV en NHP, la FV en los plasmas de pacientes con CID resultó en un tiempo prolongado y disminución de la frecuencia de la formación del coágulo de fibrina y que el paciente FV fue, en promedio, sólo el 56% como activable con trombina también.

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Figura 1. La formación de coágulos en plasma normal combinado de referencia humano, medido con la cinética de microplacas FV 1-etapa de ensayo de coagulación. Formación del coágulo de fibrina en NHP se controló continuamente a 405 nm utilizando un lector de microplacas cinético. La trama es la salida del lector de microplacas de una reacción de 6 min de 32-veces NHP diluida, plasma deficiente en FV, tromboplastina, y cloruro de calcio en un pocillo de microplaca. El eje vertical representa el cambio en la absorbancia a 405 nm que se produjeron como resultado de la formación de fibrina en plasma. El tiempo de formación de fibrina se definió como el tiempo para alcanzar el máximo aumento medio en la absorbancia o el punto medio de la curva (36.40 segundos). La velocidad inicial de formación del coágulo se define como la tasa de cambio de absorbancia a 405 nm en los puntos de tiempo primero 5 del incremento lineal de la porción de absorbancia de la curva (611,88 mUnidades / min). El extienda de campaña de la formación del coágulo se definió como la diferencia entre la absorbancia máxima y mínima a 405 nm (0,35 unidades).

Figura 2. Las curvas de calibración de tiempo y velocidad inicial de formación de coágulos frente a la actividad normal de Factor V en una mezcla de plasma de referencia humana utilizando la FV 1-etapa microplaca de ensayo. NHP se diluyó en serie (0 - a 512-veces en HBS) y se ensayó con la FV 1-etapa microplaca de ensayo como se describe en el protocolo. Log-log parcelas de la hora y la velocidad inicial de formación de coágulos frente a la actividad en la FV FV 1-etapa microplaca de ensayo se muestran después de un modelo de regresión lineal de los datos en los paneles A y B, respectivamente.

Muestra	1-etapa de ensayo de actividad (Unidades / ml)	1-fase de ensayo Extensión (unidades)	1-etapa de ensayo de tasa inicial (mUnidades / min)	2-etapa de ensayo de actividad (Unidades / ml)	2-etapa de ensayo de Extensión (unidades)	2-etapa de ensayo inicial Tipo (mUnidades / min)	La actividad total (unidades / ml)
NHP	1,02	0,363	744,96	7,93	0,433	375,84	6,91
Paciente 1	0,36	0,404	583,80	3,84	0,432	249,96	3,48
Paciente 2	0,67	0,416	704,04	5,28	0,469	323,16	4,61
	0,31	0,435	562,08	3,92	0,453	294,96	3,61
Paciente 4	0,39	0,435	617,04	4,14	0,462	372,60	3,75
Paciente 5	0,73	0,401	641,40	5,91	0,433	354,24	5,18
Paciente 6	0,45	0,403	600,72	4,16	0,445	393,96	3,71
Paciente 7	0,49	0,395	575,40	4,89	0,449	357,48	4,40
Paciente 8	0,19	0,448	489,00	2,89	0,450	330,48	2,70
Paciente 9	0,64	0,423	699,48	5,11	0,455	417,24	4,47

Tabla 1 Actividad de FV en NHP y en 9 pacientes que desarrollaron la coagulación intravascular diseminada (DIC). El FV 1-etapa, etapa 2, y la actividad total en el NHP y 9 plasmas de pacientes con CID se determinaron a partir de la FV 1-etapa microplaca de ensayo estándar curva de tiempo de formación del coágulo frente a la actividad FV (figura 2A) y se dan en unidades / ml. Las tasas iniciales (velocidad de aumento de la A405nm más de cinco primeros puntos de tiempo en mUnidades / min) y de las extensiones (A405nm máxima - mínima A405 nm) de formación de coágulos en la FV 1 - y 2-etapa microplaca de ensayo también se muestran.

Discussion

El método de ensayo cinético de microplacas describe el desarrollo de una novela, técnica rápida, barata y conveniente para la medición de la actividad de coagulación FV en muestras de plasma humano que no tienen (FV 1-etapa de ensayo) o se han activado intencionadamente con agregado de trombina (FV 2-etapa de ensayo). El ensayo utiliza un lector de microplacas cinético y todos los materiales y los reactivos necesarios están disponibles comercialmente o pueden ser hechos en casa. El ensayo monitoriza continuamente el cambio en la dispersión de luz de plasma durante la formación del coágulo de fibrina a 405 nm. La microplaca de ensayo tiene la ventaja de usar pequeños volúmenes de muestra de plasma (l) y es susceptible de análisis de múltiples muestras simultáneamente (hasta 12). Estos atributos de ensayo son ventajosos cuando un equipo caro y reactivos se utilizan (analizadores automatizados y los plasmas deficientes en Factor-); sólo pequeños volúmenes de muestra están disponibles (plasmas de pacientes) o el análisis de un gran número de muestras (f Durante purificación FVrom plasma).

El ensayo de microplaca FV tiene la ventaja añadida de que es conveniente, rápido, y no requiere el aislamiento y purificación de los componentes constituyentes requeridos. En comparación con el manual de inclinación de tubo ^{3, 4} y automatizados ^5-7 ensayos de FV que se ha informado, el ensayo de microplaca FV tiene rango comparable útil de tiempos de coagulación (25-75 seg) y los correspondientes niveles de FV en la muestra (0,5 hasta 0.005 Unidades / ml), y la sensibilidad / límites de detección (20-80pM). En comparación con los manuales del tubo de inclinación ensayos de FV que sufren de una evaluación subjetiva visual de la formación de coágulos ^{3, 4,} el ensayo de microplaca FV permite la medición objetiva y cuantitativa de la tiempo de coagulación, del tipo inicial, y el alcance de la formación del coágulo de fibrina. En comparación con los ensayos automatizados FV que sufren de la exigencia de costosos analizadores y reactivos ^5.7, los reactivos FV microplaca de ensayo y los materiales son baratos y todos los materiales necesarios pueden ser purchased comercialmente o hecho en casa. Manual de inclinación de tubo ^{3, 4} y automatizados ^5-7 ensayos FV generalmente sólo proporcionan el tiempo de formación del coágulo; no el tiempo, del tipo inicial, y el alcance de la formación de coágulos de fibrina que son todos exactamente medido espectrofotométricamente con el ensayo de microplaca de FV. Por último, los ensayos ^5-7 inclinación manual del tubo ^3,4 y automatizado FV sufren de sólo ser capaz de medir la actividad de FV en muestras de plasma de uno en uno, mientras que el ensayo de microplaca de FV es susceptible de alto rendimiento y 12 muestras pueden ser analizaron simultáneamente.

La microplaca de ensayo se usó para demostrar que la FV en 9 plasmas de pacientes con CID fue menos activa que en NHP debido a una combinación de tiempos de coagulación retardada y menores tasas iniciales de la formación de coágulos en la FV 1-etapa ensayo. Las velocidades iniciales de la formación de coágulos en la FV 2-etapa de ensayo en los plasmas de pacientes con CID no se cambiaron de NHP. Las extensiones de la formación de coágulos en la patien DICt plasmas no fueron también cambió de NHP en la FV 1-etapa y ensayos de 2 etapas. Disminución de la FV de 1 etapa, 2 etapas y las actividades totales puede haber sido debido a un aumento del consumo FV ¹⁹ y / o inactivación ⁶ de acuerdo con otros estudios en la patogénesis de este trastorno de la sangre adquirida. Dada la extensión de la formación de coágulos en los plasmas DIC era el mismo como se observa con NHP, esta variable fue más probablemente el resultado de la concentración de fibrinógeno en el plasma deficiente en FV y no relacionada con las características de los plasmas de pacientes.

Los resultados de la microplaca de ensayo indica que la medición de la actividad de FV en muestras de plasma humano se puede obtener a partir de la tasa de tiempo inicial y de la formación de coágulos de la FV 1-etapa de ensayo y el tiempo de formación del coágulo y la actividad total de la FV 2 - etapa de ensayo. No fue posible obtener una medición cuantitativa de la actividad de FV en una muestra de plasma sobre la base de la extensión de la formación de coágulos en tél FV 1 - 2 y ensayos de etapa o la velocidad inicial de formación de coágulos en la FV 2-etapa de ensayo. Teniendo en cuenta todas las reacciones alcanzado aproximadamente el mismo grado de formación de coágulos de 0,35 a 0,45 unidades entre la absorbancia inicial antes y después de la absorbancia máxima de tromboplastina y la adición de cloruro de calcio, la medición de la extensión de la formación del coágulo no proporciona una evaluación cuantitativa de la actividad de FV en un dado muestra de plasma.

La microplaca de ensayo novedoso encontrarán uso en la investigación y clínico para la medición de la actividad de FV en muestras de plasma humano y fracciones durante su purificación a partir de plasma humano y animal. La microplaca de ensayo puede utilizarse para medir el tiempo, del tipo inicial, y el alcance de la formación de coágulos; parámetros generalmente no monitorizar simultáneamente en manuales tubo de inclinación ensayos y analizadores automatizados de coagulación. Esta información proporciona más de una evaluación cuantitativa completa de la participación de FV durante el evento de formación de coágulosen el plasma humano que ha sido previamente reportado ^3-7. Esta información es especialmente importante en la investigación y en laboratorios clínicos en la medición de cambios significativos en la actividad FV en muestras de plasma o purificado con FV o FVa. El ensayo de microplaca de FV también se puede usar para caracterizar y medir compuestos que pueden activar o inactivar FV y FVa, medir la actividad de FV en pacientes con riesgo de trombosis venosa, como resultado de la mutación FV Leiden ^{20, 21} y para controlar la actividad de FV durante su purificación a partir de plasma.

El ensayo de microplaca FV es fácilmente adaptable para medir la actividad de cualquier factor de coagulación en la vía extrínseca, intrínseca, o común utilizando el apropiado factor de plasma deficiente y reactivos para iniciar la formación de fibrina. El ensayo aumentará nuestra comprensión de la bioquímica FV a través de una medición más exacta y completa de su actividad en la investigación y los laboratorios clínicos. Finalmente, esta información tendrá un impacto positivo entornos sanitarios a través de un diagnóstico precoz y el desarrollo de tratamientos más eficaces para las personas que padecen trastornos de la coagulación, como el CID.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre de reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (Opcional)
Kinetic lector de microplacas	Molecular Devices	Spectra Max 190	SOFTmax PRO 4.3 LS software
Una mezcla de plasma normal humano de referencia	Precisión Productos Biológicos	CCN-10
Citrato trisódico	Becton Dickenson	B10242
EDTA	Becton Dickenson	B10093
FV-deficiente plasma humano 4			A partir de plasma humano fresco y almacenado en alícuotas a -70 ° C.
3 y 60ml jeringas	Becton Dickenson	309585 y 136898
Butterfly aparato	Vacutainer	367251	Calibre 20
HEPES	Sigma / Aldrich	H-3375
NaCl	Pescador	BP358-212
Tromboplastina	Trinity Biotech	T1106	Dializada frente a HBS, pH 7,4 y se almacenó en alícuotas a -70 ° C.
Cloruro de calcio	Becton Dickenson	B10070
La trombina humana 15			De plasma humano; almacenaron a -20 ° C en 50% (v / v) de glicerol.
Membrana de diálisis	Pescador	21-152-6	6 8kDa corte de peso molecular; 50mm x 3m.
Plantilla extraíble y soporte de tiras de 8 pocillos.	Nunc	14-245-63 y 469957
ELISA bandejas de lavado	BioRad	224-4872
1,5 ml de microfuga y 15 tubos de tornillo ml tapados.	Sarstedt	72690 y 62554205
Pipeta multicanal	Pescador	2703630	8 canales modelo.