Artículo de método

Una sola célula de perfiles de neuronas de la retina en desarrollo y maduro

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DOI:

10.3791/3824

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19 de abril de 2012

 , 
1Department of Genetics, Development and Cell Biology, Neuroscience Program, Iowa State University

En este artículo

Resumen

Un método para el aislamiento de células de la retina individuales y la amplificación posterior de sus ADNc se describe. Una sola célula de la transcriptómica revela el grado de heterogeneidad presente celular en un pañuelo de papel y descubre nuevos genes marcadores de poblaciones celulares raras. El protocolo de acompañamiento se puede ajustar para adaptarse a diferentes tipos de células.

Resumen

Poblaciones altamente especializados, pero muy pequeña de células juegan un papel importante en muchos tejidos. La identificación de células de tipo de marcadores específicos y programas de expresión génica para subconjuntos de células muy raras ha sido un reto con estándar de tejidos de todo el enfoque. Perfiles de expresión génica de las células individuales permite un acceso sin precedentes a los tipos de células que comprenden sólo un pequeño porcentaje del total del tejido 1-7. Además, esta técnica puede utilizarse para examinar los programas de expresión génica que se transitoriamente expresados ​​en un pequeño número de células durante las transiciones dinámicas de desarrollo 8.

Este tema de la diversidad celular surge repetidamente en el sistema nervioso central (SNC), donde las conexiones neuronales puede ocurrir entre células muy diversos 9. El número exacto de distintos tipos de células que no se conoce con precisión, pero se ha estimado que puede haber hasta 1.000 tipos diferentes de la corteza itself 10. La función (s) de los complejos circuitos neuronales puede confiar en algunos de los tipos raros neuronales y los genes que expresan. Al identificar nuevos marcadores y ayudando a clasificar molecularmente diferentes neuronas, el enfoque de una sola célula es particularmente útil en el análisis de tipos de células en el sistema nervioso. También puede ayudar a dilucidar los mecanismos de desarrollo neuronal mediante la identificación de genes expresados ​​diferencialmente y vías genéticas durante las primeras etapas del desarrollo neuronal progenitora.

Como un pañuelo de papel simple, de fácil acceso a la diversidad neuronal considerable, la retina de los vertebrados es un excelente sistema modelo para estudiar los procesos de desarrollo celular, la diferenciación neuronal y la diversificación de las neuronas. Sin embargo, como en otras partes del sistema nervioso central, esta diversidad celular puede presentar un problema para la determinación de las vías genéticas que conducen a la retina progenitores a adoptar un destino específico de célula, sobre todo teniendo en cuenta que fotorreceptores de los bastones conforman el mayoría de la población total de células de retina 11. Aquí se presenta un método para la identificación de las transcripciones expresadas en células de la retina individuales (Figura 1). La técnica del perfil de una sola célula permite la evaluación de la cantidad presente de la heterogeneidad dentro de las diferentes poblaciones celulares de la retina, 2,4,5,12. Además, este método ha revelado una gran cantidad de nuevos genes candidatos que pueden jugar un papel (s) en el destino de la célula de toma de decisiones que se producen en la población de células progenitoras de la retina 8. Con algunos ajustes sencillos para el protocolo, esta técnica puede ser utilizada para diferentes tejidos y tipos de células.

Protocolo

1. La disociación de la célula

  1. Un diagrama de flujo delineando el protocolo que se muestra es la Figura 1. Para los números de catálogo de los reactivos particulares utilizados en este protocolo, por favor refiérase a la Tabla 1. Disección de la retina en un baño de PBS. Durante la disección, lo mejor es eliminar el vítreo y el cristalino ya que mantener con la retina puede impedir la disociación. No siempre es críticamente importante para eliminar todo el epitelio pigmentoso de la retina (EPR) y en algunos casos, puede ser imposible eliminarlo completamente. Sin embargo, para experimentos de células individuales de perfiles de fotorreceptores, del RPE deben ser eliminados. Si no se retira el EPR puede conducir a la contaminación de los perfiles de varilla de células del EPR con los genes expresados. Esto es presumiblemente debido a la conexión entre los fotorreceptores y RPE el.
    Para la disociación, enteros retinas murinos adultos se incuban a 37 ° C durante 10 min en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 20l papaína activado, 20 l 25 mM en cisteína 5 mM EDTA, y 360 l de Hank solución salina equilibrada (HBSS) suplementado con 10 mM de HEPES. Filtro de punta puntas de las pipetas se utilizan para todas las etapas de todo el protocolo para minimizar la contaminación potencial. La concentración de papaína y el tiempo de incubación puede variar según la edad y la naturaleza del tejido. Por ejemplo, para disociar el desarrollo de retinas aisladas en el día postnatal 0 (P0), incubar la retina en 10 l papaína activado, 10 l 25 Cisteína mM en EDTA 5 mM, y 380 l de Hank solución salina equilibrada (HBSS) suplementado con 10 mM de HEPES durante 10 minutos a 37 ° C. Retinas de diferentes especies requieren también unas condiciones ligeramente diferentes. Retinas de pollo son más delgadas que las retinas de ratones en la mayoría de las etapas de desarrollo. Utilizando 10 l papaína activado, 10 l 25 mM en cisteína 5 mM EDTA, y solución salina equilibrada de 380 l de Hank (HBSS) suplementado con HEPES 10 mM durante 5 min a 37 ° C es suficiente para disociar tstos retinas.
  2. Golpear suavemente el tubo para desalojar las células establecidas, a continuación, se tritura suavemente 10-20 veces con una pipeta P1000. Incubar durante 10 min adicionales a 37 ° C si grumos grandes de tejido persistir y luego volver a triturar-10-20 veces.
  3. Añadir 5 l de DNasa I (10 U / l) y se incuba durante 5 min a temperatura ambiente. Se tritura suavemente con una pipeta P1000. El número exacto de veces que tendrá que ser determinada empíricamente, pero generalmente está entre 10-20.
  4. Centrifugar en una centrífuga de sobremesa a 3000 rpm durante 3 min Eliminar el sobrenadante, dejando 100-200 l de líquido en la parte inferior, y toca el tubo para desalojar el sedimento. Añadir 1 ml de HBSS y resuspender el precipitado con trituración suave. Al tocar el tubo es crítico aquí simplemente como resuspender el sedimento con muchos de lisar las células de la retina. Esto es especialmente cierto con adultos retinas murinas.
  5. Se centrifuga a 3000 rpm durante 3 minutos con cuidado separar el sobrenadante y resuspender en 450 l de PBS que contienenIng. 0,1% de BSA. Es importante eliminar la mayor cantidad del sobrenadante como sea posible para minimizar la presencia de ARNm de células lisadas y cualquier producto de la disociación que podría inhibir reacciones futuras.

2. Recolección de las células individuales

  1. Preparar dos platos 6 cm que contienen 5 ml de PBS suplementado con 0,1% de BSA. Placa las células disociadas en una sola placa y permiten que las células que conformarse con al menos 5 minutos. La densidad celular utilizada depende en gran medida de la naturaleza de las células individuales se perfiladas. Por ejemplo, para las células muy raras marcadas con un marcador fluorescente tal GFP, enteras retinas disociadas se colocan en un solo plato de 6 cm. Para las células que son algo más abundantes, menos células se sembraron inicialmente para hacer más fácil para cosechar una (o muy cerca de uno) de células con la micropipeta primero.
  2. Colocar la placa de células disociadas en un microscopio invertido. Utilizamos el modelo de las IMT-2 de Olympus. Uso de pipetas que se han sometido a una fine punta (diámetro interno 0,5 mm, diámetro exterior 1,04 mm) (Figura 2) y, junto con un tubo aspirador, cosechar una sola célula. Las células entran fácilmente en la micropipeta cuando se coloca cerca de ellos en el plato. Es muy importante que el tubo de aspiración no es ni demasiado largo ni demasiado corto para que la distancia a la etapa asociada con el microscopio invertido (Los tubos aspiradores que utilizamos con nuestro microscopio invertido son 38,1 cm de largo). Si el tubo es demasiado largo, las células no pueden ser expulsados ​​de manera eficiente de la micropipeta en el tubo de recogida. La razón principal por la que utilizar el viejo modelo de las IMT-2 microscopio invertido es que hemos encontrado que tiene la distancia ideal para el escenario para nuestros tubos aspiradores de montaje. Después de entrar en la micropipeta, la célula (o células) es expulsado a una segunda placa (placa de lavado) para asegurar que una y solamente una célula se cosecha para perfiles de expresión génica. En la segunda placa a menudo es necesario para eliminar cualquiera de las células extrañas con una micropipeta nuevao mover la célula de interés en una ubicación diferente para asegurar que sólo una única célula entra en la micropipeta.
  3. Cuando una célula individual está completamente aislado de las células vecinas, utilizar una micropipeta nueva para aspirar la célula de interés como en la sección 2.2 y luego expulsar directamente en un tubo de 0,2 ml de tampón de PCR que contiene 4,5 l de lisis celular. La célula es expulsado hacia el lado del tubo, teniendo cuidado de no romper la punta de la micropipeta en el tubo. Las muestras pueden ser hilados brevemente en una microcentrífuga de sobremesa para sumergir la celda en tampón de lisis. Este giro se hace generalmente después de cada célula quinta y luego de nuevo al final de collection.Tubes que contienen las células individuales en tampón de lisis se mantuvo en hielo durante la duración del aislamiento de células individuales. Para obtener resultados óptimos, las células individuales se recogen dentro de una ventana de dos horas después de la disociación. Después de este tiempo ha transcurrido, lo mejor es proceder a la etapa de transcripción reversa ya que el tiempo adicional ha sido observablesed para aumentar las posibilidades de la degradación del ARN.

3. Transcripción inversa

  1. En pocas palabras hacer girar las muestras en una mesa de trabajo minicentrifuge para asegurar que todas las células individuales están inmersos en el tampón de lisis celular. Para promover la lisis celular, incubar la muestra a 70 ° C durante 90 seg. en un termociclador. Inmediatamente colocar los tubos de nuevo en hielo.
  2. Dejar los tubos en hielo durante 2 min. Para todas las adiciones de reactivos, usar el filtro de punta punta de la pipeta para evitar la contaminación. Para realizar la transcripción reversa, añadir 0,33 l III Superíndice (200 U / l), 0,05 l inhibidor de RNasa (40 U / l), y 0,07 l proteína T4 gen 32. Incubar la mezcla de reacción durante 50 min a 50 ° C en un termociclador. Inactivar la enzima a 70 ° C durante 15 minutos y el lugar en hielo.
  3. Para quitar el cebador libre, añadir 0,1 Tampón Exonucleasa l (10X), 0,8 l dH 2 0 (grado biología molecular), y 0,1 l exonucleasa I (20 U / l). Incubar a 37 ° C durante 30 min enun termociclador. Inactivar la enzima mediante la incubación de la reacción a 80 ° C durante 25 min y luego colocando los tubos en hielo.

4. Tizón y Single Cell-PCR

  1. Añadir 6 l de la mezcla de reacción de asimetría y utilizar un termociclador de incubar la muestra a 37 ° C durante 20 min, 70 ° C durante 10 min, y mantener a 4 ° C
  2. Añadir 10 l de la muestra de cola a la mezcla de reacción de PCR y realizar la síntesis de la segunda cadena y amplificación por PCR utilizando las siguientes condiciones:
    1. 95 ° C durante 2 min
    2. 37 ° C durante 5 min
    3. 72 ° C durante 16 min
    4. 93 ° C durante 40 seg
    5. 67 ° C durante 1 minuto
    6. 72 ° C durante 6 minutos, añadiendo 6 segundos por ciclo
    7. Vaya al paso 4 34 veces
    8. 72 ° C durante 10 min
    9. Mantener a 4 ° C

5. Las etiquetas de los chips de Affymetrix

  1. Etiqueta 10-20 ug de ADNc (la concentración del resultado ADNc amplificadoción de una sola célula es generalmente ~ 1 g / l) para obtener una hibridación en microarrays de Affymetrix robusta. En primer lugar, el fragmento de ADNc mediante la adición de 10-20 l de la ADNc sola célula a 8 l 1X Uno-Phor-All tampón y 1 l de diluida (1:10 en 1X Uno-Phor-All tampón) DNaseI en un 80 l reacción. Incubar en un termociclador de 13 min a 37 ° C. Inactivar la DNasa I durante 15 minutos a 100 ° C y se pone en hielo.
  2. Añadir 20 l tampón 5X TdT, 2,5 l de biotina N6-ddATP (Enzo Biosciences), y 1 l TdT (diluido 1:8 en tampón TdT).
  3. Incubar durante 90 min a 37 ° C, y luego 5 min a 65 ° C. Almacenar a -20 ° C o hibridación de inmediato a un microarray de Affymetrix. La hibridación se lleva a cabo utilizando los protocolos estándar de Affymetrix.

6. Los resultados representativos

Para evaluar la calidad de la l de ADNc, 10 de la muestra de ADNc se cargó en un 1% en gel de agarosa. El ADNc se juzga principalmente por el rango de tamaño (500-2000 pb)y la intensidad de la tinción de ADNc (Figura 1 y Figura 3a). En el gel se muestra en la Figura 1, cada otro carril muestra un frotis de ADNc a partir de células retinianas aislado E16.5. Los carriles de en medio de mostrar las manchas que resultan cuando los medios de comunicación sólo se aspira en la aguja y se deposita en el tubo de PCR. Estos carriles nunca son completamente desprovisto de un frotis débil, pero no muestran ningún resultado cuando genes específicos de cebadores de PCR se utilizan para amplificar los genes de ellos. Adicionalmente, la intensidad de la tinción de ADNc puede variar algo (compárese la Figura 1 y Figura 3a). En la Figura 3a carriles a, f, g, yh contienen sólidos frotis de ADNc mientras carriles b, c, d, ye son considerablemente menos robusta.

Gen-PCR específica se utiliza como una pantalla secundaria de la calidad del ADNc de una sola célula. El ADNc de la Figura 3 se aislaron de fluorescentes las células ganglionares de la retina y que eran tested utilizando los cebadores de PCR para la retina las células ganglionares de marcadores Brn3b y Pax6. Para este ensayo, 1 l de la ADNc se sometió a PCR durante 30 ciclos. En tiempo real PCR cuantitativa sería preferible un ensayo, pero puede ser prohibitivamente caro y no es necesaria para evaluar la calidad simplemente ADNc. Todos los 8 de las células individuales dio positivo para Brn3b y 6 de cada 8 para Pax6 (Figura 3b). Incluso las manchas de cDNA que fueron menos robustos bandas producidas por Brn3b y Pax6. A pesar de estos resultados de la PCR, es nuestra experiencia que los frotis de ADNc como los de carriles b, c, d, ye no producen hibridaciones en matrices sólidas Affymetrix y se evitan generalmente. Gene PCR específica para el fotorreceptor Crx marcador se utilizó para determinar el nivel de contaminación en los ADNc de células individuales (Figura 3b). Un marcador fotorreceptor fue elegido debido a que estas células constituyen la mayoría de la retina (~ 70%) y, por lo tanto, cualquier lisis celular que se produjo muy probablemente implican varilla photoreceptors. Había sólo una cantidad débil de Crx presente en estas preparaciones de cDNA incluso después de 30 ciclos de PCR. Por último, esta pantalla basado en la PCR puede utilizarse para comenzar a determinar qué subconjuntos de un tipo de célula particular, los ADNc se obtuvieron a partir antes de someterlos a un perfil completo de microarrays. Esto puede ayudar a priorizar las células que están perfiladas, como este es el paso más caro en el proceso. Por ejemplo, hemos identificado subconjuntos de células ganglionares de la retina por cribado ellos por la presencia del gen Tachykinin1 (Figura 3b).

Desde la pequeña pantalla basado en la PCR, en particular las células individuales se eligen y sus ADNc hibridado con un microarray de Affymetrix. Los datos de microarrays se compara y los patrones pueden ser descubiertos utilizando algoritmos estándar de agrupación. Heatmaps, tales como en la Figura 4, se generan para representar gráficamente los datos. Hay dos conclusiones principales en relación con los datos de las celdas individuales de perfiles en la figura4. En primer lugar, los genes expresados ​​en tipos celulares específicos se encuentran casi exclusivamente en aquellos tipos de células después de que el protocolo de única célula se lleva a cabo. En la mayoría de los casos en que los genes marcadores de un tipo de células se encuentran también en un segundo tipo celular, tales como la observación de que las células bipolares expresar algunos genes "vara" a niveles más bajos, esta expresión en el segundo tipo celular es fácilmente confirmado por ya sea in situ hibridación o tinción de anticuerpos. En segundo lugar, dentro de la más diversa amacrinas y los perfiles de las células ganglionares, la heterogeneidad de la expresión génica es inmediatamente evidente. Pou4f1 sólo se expresa en aproximadamente 1/4 de las células ganglionares en desarrollo, mientras que Nr4a2 y Scube2 son dos ejemplos de los genes expresados ​​en forma heterogénea diferentes células amacrinas. De hecho, los genes se muestran en la heatmap son sólo una pequeña muestra como varios cientos de genes han sido identificados y se confirmó como marcadores de células ganglionares en desarrollo o como marcadores de diferentes poblaciones de células amacrinas 2,4.

figure-protocol-1
Figura 1. Diagrama de flujo del método de celdas de un solo perfil. Retinas primeros son aislados y se disocia en las células individuales usando la papaína. En segundo lugar, las células individuales se cosechan con una aguja de cristal sacó y se deposita en tubos para PCR. Las células se lisaron y el ADNc amplificado utilizando la transcripción reversa seguida por PCR. La calidad de ADNc resultante se evalúa sobre un gel de agarosa tal como la que se muestra. Después de la escalera de ADN en el primer carril, los carriles de mostrar el frotis de cDNA a partir de células individuales (indicado por los corchetes rojos) que alternan con los productos de amplificación de los controles de los medios de comunicación. Los frotis de esta calidad (entre paréntesis rojos) se hibridó con microarrays de Affymetrix.

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Figura 2. Fotos de las agujas y el montaje del tubo aspirador. Células individuales se aíslan mediante la acción capilar de unsacó vidrio micropipeta (diámetro interno 0,5 mm, diámetro exterior 1,04 mm) y se transfieren por la presión de soplado en el aspirador. Es importante que el tubo aspirador es a la vez suficientemente largo para manipular fácilmente y lo suficientemente corto para descargar de forma fiable las células individuales. Una vista cercana del tubo capilar empujado a una aguja se muestra en B.

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Figura 3. Ejemplo representativo de los frotis celulares individuales de cDNA y PCR de genes específicos. Para determinar la calidad de la célula después de la amplificación de cDNA, 10 l de cada muestra de células solo se ejecutaron en un gel de agarosa al 1% junto con un control negativo (A). Una prueba debería aparecer entre 500-2000 pb. Adicional basado en la PCR de detección de genes específicos puede ayudar a identificar y / o confirmar el tipo de célula que se aisló y la cantidad de contaminación presente en la muestra (B). Cebadores específicos para las células ganglionares retinianas marcadores Brn3by Pax6 se ensayaron para confirmar la identidad de estas células (filas 1 y 2). Para evaluar el grado de contaminación de los fotorreceptores en la preparación, primers específicos para el Crx fotorreceptor marcador se utiliza (fila 3). Subconjuntos de células ganglionares también pueden ser identificados a través de la detección de marcadores como Tachykinin1 (fila 4).

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Figura 4. Expresión de células única de genes marcadores. Los resultados de microarrays de genes seleccionados se expresan en 22 celdas individuales se puede apreciar en un formato de mapa de calor. Las intensidades de las señales de microarrays se han reducido para que corresponda con la intensidad del color rojo. Negro indica la ausencia de señal en el microarray. Las células ganglionares de la retina (RGC) precursores mostrados fueron aisladas de los puntos de tiempo embrionarias, mientras que las otras células se aislaron de las retinas de adultos.

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Discusión

Un número cada vez mayor de los estudios están revelando robusta célula a célula de la variabilidad en las poblaciones que se creían ser más homogéneos en cuanto a su expresión de genes 6,8. En al menos un caso, esta expresión de los genes "ruido" se ha demostrado que desempeña una importante función biológica 13. Las diferencias de expresión génica entre las células individuales se oculta utilizando tejidos tradicionales de todo el método. Estos experimentos generar el perfil de expresió...

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Referencias

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