Una sola célula de perfiles de neuronas de la retina en desarrollo y maduro

Resumen

Un método para el aislamiento de células de la retina individuales y la amplificación posterior de sus ADNc se describe. Una sola célula de la transcriptómica revela el grado de heterogeneidad presente celular en un pañuelo de papel y descubre nuevos genes marcadores de poblaciones celulares raras. El protocolo de acompañamiento se puede ajustar para adaptarse a diferentes tipos de células.

Resumen

Poblaciones altamente especializados, pero muy pequeña de células juegan un papel importante en muchos tejidos. La identificación de células de tipo de marcadores específicos y programas de expresión génica para subconjuntos de células muy raras ha sido un reto con estándar de tejidos de todo el enfoque. Perfiles de expresión génica de las células individuales permite un acceso sin precedentes a los tipos de células que comprenden sólo un pequeño porcentaje del total del tejido ^1-7. Además, esta técnica puede utilizarse para examinar los programas de expresión génica que se transitoriamente expresados ​​en un pequeño número de células durante las transiciones dinámicas de desarrollo ^8.

Este tema de la diversidad celular surge repetidamente en el sistema nervioso central (SNC), donde las conexiones neuronales puede ocurrir entre células muy diversos ^9. El número exacto de distintos tipos de células que no se conoce con precisión, pero se ha estimado que puede haber hasta 1.000 tipos diferentes de la corteza itself ^10. La función (s) de los complejos circuitos neuronales puede confiar en algunos de los tipos raros neuronales y los genes que expresan. Al identificar nuevos marcadores y ayudando a clasificar molecularmente diferentes neuronas, el enfoque de una sola célula es particularmente útil en el análisis de tipos de células en el sistema nervioso. También puede ayudar a dilucidar los mecanismos de desarrollo neuronal mediante la identificación de genes expresados ​​diferencialmente y vías genéticas durante las primeras etapas del desarrollo neuronal progenitora.

Como un pañuelo de papel simple, de fácil acceso a la diversidad neuronal considerable, la retina de los vertebrados es un excelente sistema modelo para estudiar los procesos de desarrollo celular, la diferenciación neuronal y la diversificación de las neuronas. Sin embargo, como en otras partes del sistema nervioso central, esta diversidad celular puede presentar un problema para la determinación de las vías genéticas que conducen a la retina progenitores a adoptar un destino específico de célula, sobre todo teniendo en cuenta que fotorreceptores de los bastones conforman el mayoría de la población total de células de retina ^11. Aquí se presenta un método para la identificación de las transcripciones expresadas en células de la retina individuales (Figura 1). La técnica del perfil de una sola célula permite la evaluación de la cantidad presente de la heterogeneidad dentro de las diferentes poblaciones celulares de la retina, ^2,4,5,12. Además, este método ha revelado una gran cantidad de nuevos genes candidatos que pueden jugar un papel (s) en el destino de la célula de toma de decisiones que se producen en la población de células progenitoras de la retina ^8. Con algunos ajustes sencillos para el protocolo, esta técnica puede ser utilizada para diferentes tejidos y tipos de células.

Protocolo

1. La disociación de la célula

1. Un diagrama de flujo delineando el protocolo que se muestra es la Figura 1. Para los números de catálogo de los reactivos particulares utilizados en este protocolo, por favor refiérase a la Tabla 1. Disección de la retina en un baño de PBS. Durante la disección, lo mejor es eliminar el vítreo y el cristalino ya que mantener con la retina puede impedir la disociación. No siempre es críticamente importante para eliminar todo el epitelio pigmentoso de la retina (EPR) y en algunos casos, puede ser imposible eliminarlo completamente. Sin embargo, para experimentos de células individuales de perfil....

Discusión

Un número cada vez mayor de los estudios están revelando robusta célula a célula de la variabilidad en las poblaciones que se creían ser más homogéneos en cuanto a su expresión de genes ^6,8. En al menos un caso, esta expresión de los genes "ruido" se ha demostrado que desempeña una importante función biológica ^13. Las diferencias de expresión génica entre las células individuales se oculta utilizando tejidos tradicionales de todo el método. Estos experimentos generar el perfil de expresió.......