El sistema de ECIS / taxis es un sistema automatizado en tiempo real, análisis que mide la quimiotaxis celular. En este ensayo, las células se mueven por debajo de una capa de agarosa para llegar a un electrodo de destino. Movimiento celular se mide por la aparición de resistencia a 0 corriente alterna.
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Artículo de método
La medición de la quimiotaxis celular con ECIS / taxis
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Resumen
Resumen
El movimiento celular en respuesta a los estímulos externos es fundamental para muchos procesos celulares, incluyendo la cicatrización de heridas, la inflamación y la respuesta a la infección. Un método común para medir la quimiotaxis es el ensayo de la cámara de Boyden, en el cual las células y quimioatrayentes están separados por una membrana porosa. Como las células migran a través de la membrana hacia el quimioatrayente, se adhieren a la parte inferior de la membrana, o una caída en los medios de comunicación subyacentes, y posteriormente se tiñeron y visualmente contado 1. En este método, las células se exponen a un gradiente quimioatrayente empinada y transitorios, que se piensa que es una representación pobre de gradientes encontrados en tejidos 2.
Otro sistema de ensayo, el bajo-agarosa quimiotaxis ensayo, 3, 4 movimiento de las células medidas a través de un sustrato sólido en una delgada película acuosa que forma bajo la capa de agarosa. El gradiente que se desarrolla en la agarosa es poco profunda y se piensa que es una aplicaciónropriate representación de origen natural gradientes. La quimiotaxis puede ser evaluada por la imagen microscópica de la distancia recorrida. Tanto el ensayo de la cámara de Boyden y el ensayo de bajo-agarosa se suelen configurar como ensayos de punto final.
El sistema automatizado de ECIS / taxis sistema combina el enfoque de menores de agarosa con detección de impedancia eléctrica de la célula-sustrato (ECIS) 5, 6. En este ensayo, los electrodos de destino se encuentra en cada una de 8 cámaras. Una gran contra-electrodo se ejecuta a través de cada una de las cámaras 8 (Figura 2). Cada cámara está llena de agarosa y dos pozos pequeños son el corte en la agarosa a cada lado del electrodo de destino. Uno así se llena con la población de células de prueba, mientras que el otro tiene las fuentes de quimioatrayente difusora (Figura 3). Actual pasa a través del sistema se puede utilizar para determinar el cambio en la resistencia que se produce como células pasan sobre el electrodo de destino. Las células en el objetivo electrode incrementar la resistencia del sistema 6. Además, las rápidas fluctuaciones en la resistencia representan cambios en las interacciones de las células con la superficie del electrodo y son indicativos de cambios en la forma en curso celulares. El sistema ECIS / taxis pueden medir el movimiento de la población celular en tiempo real durante períodos prolongados de tiempo, pero también es lo suficientemente sensible para detectar la llegada de una sola célula en el electrodo de destino.
Dictyostelium discoidium se sabe que migran en presencia de un gradiente de folato 7, 8 y su respuesta quimiotáctica puede medir con precisión por ECIS / taxis 9. Quimiotaxis de los leucocitos, en respuesta a SDF1α y antagonistas de quimiotaxis También se ha medido con ECIS / taxis 10, 11. Un ejemplo de la respuesta de leucocitos a SDF1α se muestra en la Figura 1.
Protocolo
1. ECIS / taxis Preparación de electrodos
- La superficie de oro de la matriz de electrodos ECIS / taxis (que consta de 8 cámaras por diapositiva) se estabiliza por primera pre-tratamiento con cisteína estéril 10 mM en agua desionizada (dH 2 O) durante 15 min a temperatura ambiente bajo condiciones estériles.
- Aspirar la solución de cisteína de cada cámara de electrodo, enjuagar 3 veces con agua estéril O dH 2, y reemplazar con 250 l de medio completo (RPMI 1640, FBS al 10%, 25 mM de tampón HEPES).
- Conecte el conjunto de electrodos en contacto con alfileres en tenedor del instrumento matriz para realizar la comprobaci....
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Discusión
Nuevas características de la prueba de ECIS / taxis incluyen su capacidad de automatizar la recopilación de datos en tiempo real, como las células responden a quimioatrayente. Aunque la aplicación más común de esta tecnología consiste en medir la respuesta celular a los gradientes quimiotácticos individuales, o de los gradientes de compuestos de mezclas de agonistas y antagonistas de la quimiotaxis, el enfoque de ECIS / taxis también es susceptible a las modificaciones de estas configuraciones que pueden ser muy útiles .......
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Divulgaciones
David A Knecht y Michael A Lynes tienen una patente concedida por la tecnología ECIS / taxis, la cual ha sido licenciada por la Universidad de Connecticut para Biofísica Aplicada, Inc.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (ES07408 y EB00208).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre de Reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| ECIS Zθ | Biofísica Aplicada | http://www.biophysics.com/prodducts_Ecisz0.php | |
| ECIS conjunto de electrodos | Biofísica Aplicada | 8W quimiotaxis | http://www.biophysics.com/cultureware.php |
| Seakem GTG agarosa | BioWhittaker Molecular de aplicaciones | 50070 | |
| RPMI1640 | Cellgro | 10-040 | |
| HyClone de suero fetal bovino | Thermo Scientific | SH300703 | |
| Penicillin / estreptomicina | MP Biomedicals | 1670049 | La penicilina 5.000 UI / ml; estreptomicina 5 mg / ml |
| Tampón HEPES | MP Biomedicals | 1688449 | Solución 1 M, célula grado cultura |
| 14 Gauge cánula de acero inoxidable (2) 4 pulgadas | Laboratorio General de Abastecimiento | 5-8365-1 | Punta roma |
Referencias
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
- Lauffenburger, D. A., Tranquillo, R. T., Zigmond, S. H. Concentration gradients of chemotactic factors in chemotaxis assa....
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Reimpresiones y permisos
