Un ensayo de cribado para la identificación de moduladores fluorescente de canales GIRK

Resumen

Un tiempo real procedimiento de detección para identificar los medicamentos que interactúan con la proteína G-gated K hacia el interior del rectificador ⁺ (GIRK) canales se describe. El ensayo utiliza la membrana potencial sensibles tintes fluorescentes para medir la actividad GIRK canal. Esta técnica es adaptable para su uso en un número de líneas celulares.

Resumen

G cerradas en proteínas internas del rectificador de K ⁺ (GIRK) los canales funcionan como mediadores celulares de una amplia variedad de hormonas y los neurotransmisores y se expresan en el cerebro, corazón, músculo esquelético y ^1,2 tejido endocrino. GIRK canales se activan tras la unión de ligandos (neurotransmisores, hormonas, medicamentos, etc) para su plasma unida a la membrana, acoplados a proteínas G receptores (GPCR). Esta unión hace que la estimulación de las proteínas G (G _i y _o G) que posteriormente se unen y activan el canal GIRK. Una vez abierto el canal GIRK permite el movimiento de K ⁺ fuera de la célula causando la membrana en reposo potencial de ser más negativo. Como consecuencia, la activación GIRK canal en las neuronas disminuye la formación espontánea potencial de acción e inhibe la liberación de neurotransmisores excitatorios. En el corazón, la activación del canal GIRK inhibe la actividad de marcapasos por lo tanto reducir la frecuencia cardíaca. 3. Sin embargo, la farmacología de estos canales sigue siendo en gran parte inexplorado. A pesar de una serie de fármacos, incluyendo agentes antiarrítmicos, antipsicóticos y antidepresivos bloquear el canal GIRK, esta inhibición no es selectiva y se presenta en concentraciones relativamente altas de drogas ^3.

A continuación, describimos un ensayo de cribado en tiempo real para la identificación de nuevos moduladores de canales GIRK. En este ensayo, las células neuronales AtT20, expresando canales GIRK, se cargan con el potencial de membrana sensibles tintes fluorescentes tales como bis-(1,3-dibutylbarbituric ácido) trimethine oxonol [DiBAC ₄ (3)] o HLB 021-152 (Figura 1 ). Las moléculas de colorante convertido absorción siguiente fuertemente fluorescente en las células (Figura 1). Tratamientode las células con ligandos GPCR estimula los canales GIRK para abrir. El resultante salida de K ⁺ fuera de la célula hace que el potencial de membrana a ser más negativo y la señal fluorescente a disminuir (Figura 1). Así, los fármacos que modulan la salida de K ⁺ a través del canal GIRK puede ensayarse utilizando un lector de placa fluorescente. A diferencia de otros ensayos de detección de iones de canal, como la espectrometría de absorción atómica ⁴ o ⁵ radiotrazador de análisis, el ensayo GIRK canal de fluorescencia proporciona un procedimiento de detección rápida, en tiempo real y de bajo costo.

Protocolo

1. Preparación de las células

1. Crece pituitarias AtT20 células en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de caballo al 10% y mantener cultivos a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO _2.
2. Mantener el cultivo por las células subcultivo cada 5 a 7 días utilizando un procedimiento estándar tripsinización.
3. Cubra los pocillos de fondo negro, claro, placas de 96 pocillos con 50 l de ácido poli-L-lisina. Permita que los pozos se sequen durante 30 minutos en la incubadora.
4. Placa de las células en las placas de 96 pocillos que contienen 200 l de medios a una densidad de 30.000 células por....

Discusión

Si bien el potencial de membrana sensibles tintes fluorescentes se han utilizado para identificar los fármacos que modulan los canales iónicos ^9,10, este es el primer informe de su aplicación para las neuronas de drogas GIRK Discovery Channel. El ensayo GIRK canal de fluorescencia que aquí se presenta ofrece un método rápido, fiable y en tiempo real para la detección de ligandos canales de K ^+. El ensayo puede ser modificado para su uso con una amplia gama de células inmortalizadas, incluyendo líne.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
DMEM	CellGro	10-013
El suero de caballo	Invitrogen	16050-114
Placas de 96 pocillos	Corning	3603
Poli-l-lisina	Sigma-Aldrich	P4707
La somatostatina	Sigma-Aldrich	S9129
Carbacol	Sigma-Aldrich	C4382
HLB 021-152	AnaSpec	89300
Versette controlador de líquido automatizado	ThermoFisher	650-01
Synergy2 lector de placas fluorescentes	Biotek
Gen5 análisis de software	Biotek

Tabla 1. Tabla de reactivos y equipos específicos.