Summary
マウス胚性線維芽細胞（MEF）の品質は、例えば、CF-1のようなマウスの右歪みによって決定されます。これらから得られた多能性·支持のMEFと馴化培地（CM）が共同で動作可能な自己再生および多能性を維持するために、アクチビン/ノードおよびFGF経路に必要なアクチビンA、グレムリンとTGFβ1の最適な濃度を含める必要があります。
Abstract
一般に、ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）とヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）1は、可変条件下で培養することができます。しかし、これらの細胞を培養するための効果的なシステムを確立することは容易ではありません。培養条件は、ヒトES細胞とhiPSCsの多能性付与遺伝子発現に影響を与えることができるので、最適化および培養方法の標準化が重要である。
hESCの樹立は、最初のフィーダー細胞とウシ胎児血清（FBS）含有培地2としてのMEFを使用して記述されていた。次に、FBSはノックアウト血清代替物（KSR）、およびヒトES 3の増殖を促進するFGF2、置き換えられました。最後に、フィーダーフリーの培養システムは、KSR含有馴化培地を細胞（MEFによって条件付け培地4）にマトリゲルをコートしたプレート上で細胞培養を可能にします。その後、ヒトES細胞の培養条件は、化学的にdefinでフィーダーフリーの培養に向かって移動したEDの条件は5-7。また、異種フリーコンポーネントを使用して、病原体と動物性タンパク質の培養法による潜在的な汚染を避けるために、8を確立されている。
改良された条件を取得するには、マウスフィーダー細胞は、ヒト細胞株（例えば、胎児の筋肉や皮膚細胞9、大人の皮膚細胞10、包皮線維芽細胞11-12、羊膜間葉系細胞13）に置き換えられています。しかし、ヒト包皮線維芽細胞由来のフィーダーレイヤーを使用して未分化ヒトES細胞を維持するための効率は14アクチビンの分泌の低いレベルのために、マウスフィーダー細胞からのそれと同じくらい高くはありません。明らかに、マウスとヒトのフィーダー細胞による成長因子の産生で明らかに違いがあります。
マウスとヒトのフィーダー細胞のトランスクリプトームの解析は支持と非支持細胞の間に有意差を明らかにした。外因性のFGF2はmaintaiために重要ですヒトES細胞とhiPSCsの自己再生寧と、フィーダー細胞のTGFβ1、アクチビンAとグレムリン（BMP拮抗薬）の発現を調節する重要な因子として同定されている。アクチビンAは、ヒトES細胞15から16にOCT4、SOX2、NANOGとの発現を誘導することが示されている。
長期培養では、ヒトES細胞とhiPSCsは、その未分化状態を維持するために、有糸分裂不活性化されたMEFまたはマトリゲルをコートしたプレート上でMEF-CM（MEF-馴化培地）でフィーダーフリーの条件下で成長させることができる。彼らは直接ヒトES細胞の成長に影響を与えるので、両方の培養条件の成功は、完全に、フィーダー細胞の品質に依存します。
ここでは、メディア内のアクチビンのレベルを評価するために、マウス胚性線維芽細胞（MEF）の単離および培養のために最適化された方法、条件培地（CM）と酵素免疫測定法（ELISA）の調製を示す。
Protocol
1。マウス胚線維芽細胞の単離細胞（MEF）
次の2つの手順は、非無菌条件下で行われます。
- 頸椎脱臼により13または14 DPC（日後の交尾）で妊娠したマウス（CF1、ハーラン、米国）を生け贄に捧げる。
- 子宮角を解剖し、簡単にのCa 2 +はMg 2なしでPBSを含むファルコンチューブに70％（v / v）エタノールと場所にリンス+（ギブコ社、Invitrogen社製）。
次の手順は無菌条件下で組織培養フード内で実施され、滅菌器を使用しています。
- ペトリ皿に子宮角に配置し、その胎盤や胚嚢から各胚を分離します。
- 頭と赤い器官を解剖し、PBSで洗浄し、きれいなペトリ皿の中ですべての胚を配置します。それはピペッティングすることが可能になるまで細かく滅菌カミソリの刃を用いて組織をミンチ。
- 0.05％トリプシン/ EDTA（Gibco社、Invitrogen社製）、合わせたもの含めるの1ミリリットルを追加します。胚あたりのDNase I（USB）の鼎100クニッツ単位。
- 50mlファルコンチューブに組織を移し、37℃で15分間インキュベート℃、インキュベーションの各5分後、完全に上下にピペッティングにより細胞を解離する。
- 新たに調製したMEF培地の約1ボリュームを追加することによって、トリプシンを不活性化する。
MEF培地（成分は、メディアの500ミリリットルを加え、すべてのコンポーネントを混在させると、フィルタするため）：
DMEMの450ミリリットル、FBSを50ml（10％（V / V））、200 mM L-グルタミン（1/100（v / v））を5 mlのペニシリン - ストレプトマイシンの5ミリリットル（1/100（V / v））を。 - 5分、（300×g）で、低スピードで細胞を遠心分離し、慎重に暖かいMEF培地で上清と再懸濁し、細胞ペレットを削除します。
- プレート約2時間、0.2％ゼラチン（ウシ皮膚、タイプB、シグマからゼラチン）で被覆された各T150（TPP）フラスコで3-4胚と同等であるセルの数。線維芽細胞（P0、通路0）ゼラチンコートしたフラスコにアタッチする能力を持っている唯一の細胞である。 理想的には、細胞は24時間後に80から90パーセントコンフルエントであり、この段階ではP0の細胞の大部分は将来の使用のために凍結されています。
- フィーダは、ヒトES細胞をreplateするか、または条件培地（CM）を生成するようにP3またはP4までP0の細胞の残りのT150フラスコ（s）を展開し、不活化して使用します。
2。不活化とめっきのMEF（フィーダー細胞の調製）
すべての手順は無菌条件下で組織培養フード内で行われている。
- 少なくとも2時間、室温で0.2％のゼラチンとインキュベートしたコートT150フラスコ。
- マイトマイシン、PBS中のC（1 mg / ml）とフィルタを希釈する。
- MEFのから培地を吸引除去し、Ca 2 + Mg 2 +を含まないPBSで洗浄する。
- MEFのマイトマイシンCで10μg/ mlを含む培地の代わりに20ミリリットル。
- 37℃で2時間インキュベート培地を含むマイトマイシンCとCは、その後PBS、トリプシン処理、遠心（300 xgで5分間）と、暖かい培地に再懸濁し細胞で2回洗浄する。
- 次の6日間のCM制作のためのT150フラスコ、使用中の56.000細胞/ cm 2の密度で細胞とプレートを数える。
3。馴化培地（CM）の準備
すべての手順は無菌条件下で組織培養フード内で行われている。
- 56.000細胞/ cm 2の密度hESCの培地でMEF培地を交換する（UM、無条件培地）で不活化したMEFをめっき後の日（0.5ミリリットル/ cm 2）とFGF2の4 ng / mlのと新たに補った。
- 24時間インキュベーションした後、フィーダーフラスコからCMを収集し、フィーダにFGF2の4 ng / mLを含有する新鮮なhESCの培地を追加します。
- 次の6日間に、この手順を繰り返します。毎日の-20℃でCMを集めた
- 6日には、培地とフィルター（コーニング、0.22μmの、PAS）のすべてのアリコートをミックスした後。 -80℃で50ミリリットルのアリコートとストアを行い℃の
- マトリゲル上に成長したヒトES細胞に添加する前にFGF2の追加の4 ng / mlとしたCMを補足するものです。</ LI>
4。培地にアクチビンの測定（ELISA）15
- すべてのサンプルと試薬を室温に戻します。
- マイクロプレートに追加し、1％BSAを含むPBSで（ヒューマン\ MOUSE \ラットアクチビンMAB、R＆D Systems）を捕捉抗体（100μl/ウェル）、室温で一晩インキュベート希釈します。
- 24時間は、RTで1時間ブロック（1％BSA / PBS、300 /ウェル）をPBST（0.05％Tween20を含むPBS）（300μl/ウェル）をウェルに3回洗浄した後。
- この時間内に7希釈液（30 ng / mlの未満の濃度）とブランク試料を含むアクチビン（R＆D Systems）を標準曲線を、準備します。アクチビンの線形動作範囲は0.25〜32 ng / mlである。
- ウェル（100μl/ウェル）に標準とサンプルの重複を追加し、室温で2時間インキュベートします。
- 井戸三回（PBST 300μl）を洗浄します。
- セカンダリ（ビオチン標識）抗体（マウス/ラット/ヒトモノクローナル抗体アクチビン、R＆Dシステムズビオチン）（0を追加します。25μg/ mlの1％BSA / PBS）と室温で2時間インキュベートします。
- 井戸三回（PBST 300μl）を洗浄し、ストレプトアビジン-HRP（1％BSA / PBS、R＆Dシステムズ社で希釈した）を追加し、室温で20分間インキュベートします。
- 井戸三回（PBST 300μl）を洗浄し、基質溶液を100μl（Quantikine、R＆Dシステムズ）を追加し、暗所で室温で30分間インキュベートする。
- 各ウェルに停止液を100μl（Quantikine、R＆Dシステムズ社）を加え、穏やかに混ぜる。
- 各ウェルの光学密度を決定するために、540または570 nmの波長補正で、450 nmのマイクロプレートリーダー（Molecular Devicesスペクトラマックス250、グローバル医療機器株式会社、ミネソタ州）を設定します。
5。代表的な結果
分離手順の全体的なスキームを図1に示されています。ヒトES細胞と異なる条件下で培養hiPSCsの典型的な形態は、 図2に示されています。の形態 MEFのとCMを準備するために使用不活化フィーダー細胞は、 図3に示されています。一般的に、細胞は24時間後に分離コンフルエントとフリーズしたり、展開する準備ができているはずです。しかし、時にはそれがコンフルエントに培養を取得する前に2-3日かかる場合があります。 CMが通路4としない後に細胞から調製されるべきである。初代培養細胞にのみ老化の発症前に4から5までの通路のために拡張することができますので、これは非常に重要です。
サイトカイン、アクチビンAは、多能性細胞14の未分化な成長をサポートするためにフィーダー細胞から分泌される最も重要な要因と見なされます。 CMでアクチビンのレベルの測定は、（ 図4）MEFの品質を監視するために非常に便利な定量的なアッセイである。
図1 MEFの分離手順の概略図。
図2（A）フィーダー細胞、（B）条件培地および（C）定義されている培地の存在下で培養した未分化ヒトES細胞の典型的な形態。 （D、E）フィーダー細胞の存在下で培養hiPSCsの典型的な形態。
56.000細胞/ cmの密度で3マウス胚繊維芽細胞（MEF）の典型的な形態は。二日間メッキ/分離後の（）航路0（P0）、（B）不活化フィーダー層図 2。
図4酵素免疫測定法（ELISA）ベースの馴化培地（CM）PRにアクチビンの濃度の測定CF1マウス系統から派生したマウス胚線維芽細胞でepared。 CMは6日のために収集し、プールした。 CM "1"、CM "2"は、メディアと無条件メディアへのUMの異なるバッチを参照してください。空調プロセスの関数としてUMでほぼ検出不可能であるアクチビン、MEFにして培地中に分泌アクチビンされています。
Discussion
ここで紹介するMEFの分離手順は、ヒトES細胞とhiPSCsための標準化された培養条件の確立を可能にします。また、フィーダー細胞によるサイトカイン産生を評価するために使用されるELISAベースのシステムは、MEF由来の馴化培地の質の有用な指標である。サポートしている線維芽細胞を提供するマウス系統（CF1）の定期的なメンテナンスは、培地のバッチ間の変動を回避するために必要です。また、細胞の一貫した品質を得るために同時に複数のマウスから胚を分離することをお勧めします。確かに新たに単離したMEFは、P0とP1で凍結保存することができます。また、不活化のMEFは、細胞培養のための要件に応じて適切な量のアリコートで凍結保存することができます。通常約250.000細胞を培養ヒトES細胞やiPS細胞への6ウェルプレートの単一ウェルに播種する必要があります。確立され、最適化されたメソッドは、定期的にdiffeの間でのばらつきを最小限に抑えることができます。実験を借りる。
Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
Greber らに公開されているアクチビンELISAプロトコルを設定するための博士ボリスGreberに感謝します2007。我々は、グラフィカルな概要を準備するための夫人モニカShevackに特に感謝しています。私たちは、撮影前と中にすべてのヘルプと貴重な提案のために博士ハイコ·フックスに非常に感謝しています。我々は、MEFには、CMの安定供給を維持するために特にエリーザベトSocha、アジャイ室のすべてのメンバーに感謝したい。我々はまた、永続的なサポートのためのMPIMGの動物施設で私たちの同僚を認める。本研究の一部はマックス·プランク協会によって資金を供給された[BMBF、助成金番号0315717A] ERASysBioのパートナー+ EU FP7のERA-NET Plusのスキームの下でサポートイニシアチブ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (High Glucose) | Gibco, Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | Biochrom | S0115 | |
| L-glutamine | Gibco, Invitrogen | 25030-024 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco, Invitrogen | 15140-122 | |
| Vacuum filter system | Corning | 431097 | 500 ml, 0.22 μm, PAS |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Knockout DMEM | Gibco, Invitrogen | 10829-018 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco, Invitrogen | 10828-028 | |
| Non-Essential Amino Acids | Gibco, Invitrogen | 11140-035 | |
| beta-Mercapt–thanol | Sigma | M7522 | |
| PBS | Gibco, Invitrogen | 14190-169 | |
| DNase I | Sigma | D4527 | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Basic Fibroblast Growth Factor | PeproTech | 100-18B | |
| Biotinylated Anti-human/mouse/rat Activin A Antibody | R&D Systems | BAM3381 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| Human/Mouse/Rat Activin A MAb | R&D Systems | MAB3381 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco, Invitrogen | 25300-054 | |
| Extra Thin Iris Scissors | FST | 14088-10 | |
| Extra Fine Graefe Forceps | FST | 11150-10 | |
| Pierse Fixation Forceps | FST | 18155-13 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Amit, M. Clonally derived human embryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227, 271-278 (2000).
- Xu, C. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Ludwig, T. E. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nat. Biotechnol. 24, 185-187 (2006).
- Yao, S. Long-term self-renewal and directed differentiation of human embryonic stem cells in chemically defined conditions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6907-6912 (2006).
- Lu, J., Hou, R., Booth, C. J., Yang, S. H., Snyder, M. Defined culture conditions of human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 5688-5693 (2006).
- Skottman, H., Hovatta, O. Culture conditions for human embryonic stem cells. Reproduction. 132, 691-698 (2006).
- Richards, M., Fong, C. Y., Chan, W. K., Wong, P. C., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Richards, M. Comparative evaluation of various human feeders for prolonged undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells. 21, 546-556 (2003).
- Amit, M. Human feeder layers for human embryonic stem cells. Biol. Reprod. 68, 2150-2156 (2003).
- Inzunza, J. Derivation of human embryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal human fibroblasts as feeder cells. Stem Cells. 23, 544-549 (2005).
- Zhang, K. Utilization of Human Amniotic Mesenchymal Cells as Feeder Layers to Sustain Propagation of Human Embryonic Stem Cells in the Undifferentiated State. Cell Reprogram. , (2011).
- Eiselleova, L. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int. J. Dev. Biol. 52, 353-363 (2008).
- Greber, B., Lehrach, H., Adjaye, J. Fibroblast growth factor 2 modulates transforming growth factor beta signaling in mouse embryonic fibroblasts and human ESCs (hESCs) to support hESC self-renewal. Stem Cells. 25, 455-464 (2007).
- Vallier, L., Alexander, M., Pedersen, R. A. Activin/Nodal and FGF pathways cooperate to maintain pluripotency of human embryonic stem cells. J. Cell Sci. 118, 4495-4509 (2005).
