Neuronas olfativas del receptor (ORNs) convertir señales de olor primero en un receptor de corriente que a su vez desencadena los potenciales de acción que se transmiten a las neuronas de segundo orden en el bulbo olfatorio. Aquí se describe la técnica de pipeta de succión de grabar simultáneamente el receptor de odorizantes de la corriente inducida y los potenciales de acción de ORNs ratón.
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Artículo de método
Inducidas Odorante-respuestas registradas de neuronas olfativas del receptor utilizando la técnica de aspiración con una pipeta
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Resumen
Resumen
Animales muestras del medio ambiente oloroso alrededor a través de los sistemas quimiosensoriales situados en la cavidad nasal. Señales Quimiosensoriales afectar los comportamientos complejos, como la elección de alimentos, depredador, conespecíficos y reconocimiento mate y otras señales de relevancia social. Neuronas olfativas del receptor (ORNs) se encuentra en la parte dorsal de la cavidad nasal incrustado en el epitelio olfativo. Estas neuronas bipolares enviar un axón hasta el bulbo olfatorio (ver fig. 1, Reisert y Zhao 1, originalmente publicado en la revista Journal of General Physiology) y extender una sola dendrita epitelial de la frontera desde donde irradian los cilios en el moco que recubre el olfato epitelio. Los cilios contienen la maquinaria de transducción de señales que en última instancia conduce a excitatorios afluencia corriente a través de los canales de transducción ciliar, un nucleótido cíclico-gated canal (CNG) y un Ca 2 +-activado Cl - canal (Fig. 1). El siguiente depolarización desencadena la generación del potencial de acción en el cuerpo de la célula 2-4.
En este video se describe el uso de la "técnica de succión pipeta" para grabar olor inducida por las respuestas de ORNs. Este método fue desarrollado originalmente para grabar desde fotorreceptores de los bastones 5 y una variante de este método se puede encontrar en jove.com modificado para grabar desde fotorreceptores de los conos de ratón 6. La técnica de la pipeta de aspiración fue adaptado más adelante para grabar también de ORNs 7,8. Brevemente, tras la disociación del epitelio olfatorio y aislamiento de células, el cuerpo de la célula entera de una ORN es aspirado en la punta de una pipeta de grabación. La dendrita y los cilios del permanecer expuesto a la solución del baño y por lo tanto accesibles a la solución cambia para permitir por ejemplo odorante o aplicación bloqueador farmacológico. En esta configuración, no hay acceso al medio intracelular se gana (sin fijación de voltaje de células enteras) y la tensión intracelular es libre de variar. Todo estoDebe A la grabación simultánea de la corriente del receptor lento que se origina en los cilios y los potenciales de acción rápida disparados por el cuerpo celular 9. La diferencia en la cinética entre estas dos señales que les permite ser separados utilizando diferentes configuraciones de filtro. Esta técnica se puede utilizar en cualquier tipo salvaje o el ratón knockout o de grabación selectiva de ORNs que también expresan GFP para etiquetar subconjuntos específicos de ORNs, por ejemplo, que expresa un receptor determinado olor o canal de iones.
Protocolo
1. La configuración de grabación
La cámara de registro está montado en un microscopio Nikon Eclipse TE2000U invertida con óptica de contraste de fase que está montado sobre una mesa neumática y eléctricamente blindado usando una jaula de Faraday. La cámara de grabación de Plexiglás consta de dos secciones separadas parcialmente por una barrera y pegado sobre un portaobjetos de vidrio silanizado. Una sección de la cámara se utiliza para liquidar las células, mientras que el otro se utiliza para el estímulo de la exposición durante la grabación para reducir al mínimo la exposición prematura de reiterada pero aún no utilizados a células odorante. La configuración de grabación consta de una pipeta de aspiración (ver más abajo) montado en un soporte de pipetas sedimentaron y un electrodo de tierra. La pipeta de succión se coloca utilizando un micromanipulador. Soluciones de estímulo se aplican usando un tubo de vidrio de triple cañón cuadrado, con cada tubo cuadrado siendo 0,7 mm x 0,7 mm. El cristal de triple cañón estaba conectado a un sistema de perfusión motorizado rápido a paso montado en un manipulador (Sutter SF-77B, Instrumentos Warner) y entró en la cámara de registro a un ángulo de ~ 45 °. El final de la copa barril triple fue biselado a un ángulo de 45 ° de nuevo tal que la cara final (abertura) del cristal de triple barril era vertical para permitir la colocación cerca de la pipeta.
El electrodo de pipeta de succión llena con solución de Ringer de mamíferos estándar y el electrodo de tierra están conectados a la headstage GΩ 1 de un amplificador de patch clamp (PC-501A, Warner Instruments) en el modo de fijación de voltaje. La señal analógica procedente del amplificador (filtrada paso bajo a 5 kHz) se visualiza en un osciloscopio digital para monitorizar la señal en tiempo real y también conectado a un filtro de Bessel 8-polo (Krohn-Hite) donde la señal es filtrada en paso bajo a 50 Hz. Ambas señales (filtrado de paso bajo a 5 kHz Hz 50) se introducen en un convertidor A / D (Cambridge Electronic Design Micro mkII 1401) que está conectado a un PC para la adquisición de datos. Los datos se registran utilizando Signal 3 acquisition software (Cambridge Electronic Design) a una frecuencia de muestreo de 10 kHz. La señal se registra en las dos diferentes anchos de banda para grabar primero el receptor actual junto con los potenciales de acción superpuestas y, a continuación el receptor actual solo (véase la fig. 2). El sistema de perfusión se usa para cambiar rápidamente entre Ringer (control) y solución estímulos odorantes o cualquier solución de composición deseada y es controlado por el PC y la señal 3 software. Las soluciones están contenidos en 60 ml jeringas y la tasa de flujo es controlado por grado médico reguladores de flujo por vía intravenosa. Típicamente, el caudal se fija a 1 ml / min.
La succión en la pipeta de grabación se controla de la siguiente manera: El puerto lateral del soporte de pipeta está conectado a una línea de aceite que a su vez está conectado a un depósito de aceite regulable en altura. Elevando o bajando el depósito asegura que la presión de pipeta y por lo tanto el flujo de Ringer a través de la punta de la pipette es mínimo y ligeramente positivo. De succión adicional o se puede aplicar presión a través de un tubo conectado al espacio aéreo del depósito con una boquilla en el otro extremo a chupar el cuerpo celular de una ORN aislado en la punta de la pipeta de grabación.
Los experimentos se realizaron a 37 ° C con el fin de simular con frecuencia el estado nativo fisiológico de la célula. La temperatura se controla haciendo pasar las soluciones a través de una unidad de calentamiento a medida que consta de resistores de cerámica a través de tubos de acero inoxidable que contienen las soluciones se pasan 10. La temperatura se controla usando un termómetro de termopar (Fluke).
2. Soluciones
La solución de Ringer de mamíferos (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 2 CaCl 2, 0,01 EDTA, 10 HEPES, 10 glucosa. El pH se ajustó a 7,5 con NaOH. Un 10% diluida de solución de Ringer se utilizó para medir la unión actual. Odorasoluciones nt: acetofenona y eugenol se prepararon diariamente en solución de Ringer de 20 mM de existencias de DMSO.
3. Haciendo Electrodos
- Coloque un vidrio borosilicato unfilamented capilar en un Sutter P-97 extractor de micropipeta y tirar de una micropipeta con un cono largo.
- Transferir la pipeta en un soporte micropipeta a medida montada en un microscopio Nikon Eclipse E200, que es a su vez equipado con una retícula en el ocular y una cuchilla móvil diamante montado en el escenario.
- Observe que la punta de la pipeta al objetivo de 20x y utilizando la retícula como guía; suavemente escriba la pipeta en un ángulo de 90 ° con la cuchilla de diamante a medida que la pipeta es de 10 micras de ancho (diámetro externo).
- Mueva la cuchilla de diamante más hacia la punta y gradualmente aplique presión en la punta de la cuchilla de diamante. La punta de la pipeta debe romper limpiamente en el punto en que se describe.
Alternativamente los pasos 3.1 a3,4 se pueden combinar y pipetas se puede tirar con dimensiones deseadas directamente sin tener que cortar la punta de la pipeta, aunque puede resultar más difícil tirar de forma fiable pipetas con una punta de diámetro grande y los bordes de corte limpio.
- Bajo un objetivo de 40x, disparar pulir la punta de la pipeta a un diámetro interior de 5 micras utilizando un filamento calentado eléctricamente. Una vez terminado, la micropipeta está listo para ser utilizado para corrientes de grabación desde ORNs ratón. La resistencia abierta pipeta debe estar alrededor de 1 MW cuando se llena de colores.
4. El aislamiento de las neuronas olfativas del receptor
- Sacrificar un ratón siguiendo las directrices institucionales y normativas. Retire la cabeza, retire la piel que recubre el cráneo y la cabeza medial bisecan a lo largo de la línea media.
- Coloque los dos hemi-cabezas bajo un estereomicroscopio de disección, quitar el tabique nasal y eliminar los cornetes olfativos. Colocar todo el tejido en una placa de Petri con c glucosaontaining solución Ringer mamíferos.
- Pelar el epitelio olfativo del cartílago subyacente a partir de dos cornetes y transferir el tejido en un tubo Eppendorf que contiene 250 l de Ringer. Utilizamos tejidos de 2 cornetes para conseguir la densidad adecuada de las células para el tamaño de nuestra cámara de grabación. Almacenar el tejido restante a 4 º C para su uso posterior.
- Vortex el tubo Eppendorf que contiene el epitelio olfativo brevemente dos veces durante 1 seg a velocidad media. Esta etapa conduce a la disociación mecánica de los ORNs del epitelio.
- Colocar la solución de Ringer que contenía los ORNs disociadas en la cámara de registro. Eliminar piezas grandes de tejido también presentes en la suspensión utilizando unas pinzas finas.
- Deje que los ORNs conformarse con 20 minutos antes de comenzar superfusión continuo con Ringer y proceder a las grabaciones.
5. Grabaciones
- Bajar el electrodo de succión conectado a la línea de aceite en la cámara de registro y regulcomió la altura del depósito de aceite para establecer presión ligeramente positiva en la punta de la pipeta. Esto se puede hacer mediante la observación de los restos celulares por ejemplo, alejándose de (presión positiva) o hacia (presión negativa) de la pipeta. Trate de no contaminar la punta de la pipeta con restos celulares.
- Escanear la cámara de registro para una ORN aislado que puede ser reconocido por su morfología bipolar típica usando una magnificación de 20-40x. Mueva el electrodo de registro en la proximidad del cuerpo celular ORN. Empiezan a chupar suavemente de modo que el cuerpo de la célula entra en la punta de la pipeta. Cuidadosa y lentamente continuar para aplicar succión hasta que el cuerpo de la célula entera se introduce en la punta de la pipeta de aspiración, dejando la dendrita y los cilios expuesto a la solución del baño. Para imágenes de ORNs aspirado y formas de pipeta ver 7,11. Asegúrese de que una vez que no se aplica la succión, la ORN no se mueve dentro o fuera de la pipeta. Si es así, ajustar la altura del depósito de aceite en consecuencia.
- Uso de lamicromanipuladores, mover la pipeta de aspiración de la sección que contiene las ORNs asentadas a la sección de grabación de la cámara. Colocar con cuidado la pipeta de aspiración en la parte delantera de tubo 3-cañón para el intercambio de solución. La pipeta de succión debe estar colocado lo suficientemente cerca de la abertura del tubo 3-cañón de manera que el ORN se expone a un flujo laminar evitando así la turbulencia de mezcla y para lograr el intercambio de solución rápida. La solución de intercambio se consigue mediante la intensificación de la interfaz entre corrientes paralelas de solución que fluye a través de la punta de la pipeta de aspiración. El curso temporal de la bolsa de solución es típicamente alrededor de 20 ms, medida a partir de la corriente evocada por unión intensificando la celda entre las soluciones de composición iónica diferente (véase la fig. 2). Soluciones se suministran por gravedad.
6. Los resultados representativos
Figura 1. A) neuronas bipolares del receptor en el bulbo olfatorio. B) transducción de señales en los cilios en última instancia conduce a la excitatorios afluencia actual. La despolarización resultante desencadena la generación del potencial de acción en el cuerpo de la célula.
La Figura 2 muestra la velocidad y la fiabilidad de cambio de solución. Una pipeta se salió de lo normal en 10% Ringer diluida para 100 ms y la corriente resultante de la unión de la concentración de iones de diferente fue registrada. Negro traza es el averabia de 5 intentos, rojo rastrear su SD. El pequeño cambio en SD durante el intercambio solución demuestra la fiabilidad de intercambio solución de ensayo a ensayo y la falta de exceso de ruido en la corriente de solución.
La Figura 3 muestra una respuesta eugenol inducida de un ORN utilizando la técnica de pipeta de succión. La ORN fue expuesto a 100 mM eugenol durante 1 segundo como se indica por la barra por encima de la grabación. En la fig. 3A (negro rastro) la corriente del receptor se filtró en un ancho de banda 0 - 50 Hz para mostrar sólo el receptor de la figura actual.. 3B muestra la misma grabación, ahora filtra en el ancho de banda amplio de 0 - 5000 Hz (curva roja) para visualizar también los potenciales de acción (AP, indicado por flechas). El recuadro muestra la misma traza en una escala de tiempo ampliado para visualizar los puntos de acceso más claramente en la aparición de la respuesta.
Dosis Figura 4. Respuesta de la familia de un ORN-eugenol sensible (A). El eugenol se utilizó a concentraciones que variaban de 0,3 mM a 100 mM, la duración del estímulo fue de 1 s y trazas se filtró a 0 - 50 Hz. Un incremento progresivo en la concentración de odorante condujo a una respuesta más grande y más rápido, que también se termina una vez más lentamente exposición odorante se terminó.
ORNs puede mostrar un patrón de respuesta oscilatoria durante estimulaciones largas en concentraciones odorantes intermedios (Fig. 4B). Aquí un acetephenone (3 M) ORN sensible fue estimulado durante 8 segundos. Después de un pico de respuesta rápida y transitoria en el inicio de la estimulación de una serie de pequeñas respuestas recurrentes se observan. El ancho de banda de grabación fue de 0 - 50 Hz.
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Discusión
La técnica de pipeta de succión es un método electrofisiológico que se utiliza para registrar la corriente inducida por el receptor de olor lento y los potenciales de acción rápida bifásicos de un ORN simultáneamente. Puesto que la membrana plasmática de la célula no se rompe, este método deja el medio intracelular no perturbado asegurar que las respuestas de olor no se alteren debido a los cambios de las concentraciones iónicas citoplasmáticas o dilución de factores intracelulares. Las células se pueden grabar desde...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el NIH DC009613, el Programa de Fronteras Humanas Ciencias y Morley Care Fellowship (JR).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Nombre del material | Tipo | Empresa | Catálogo / Número de modelo | Comentarios |
| Air tabla | equipo | Newport | ||
| Bomba de aire | equipo | Newport | ACGP | |
| Pipetear Puller | equipo | Sutter | P-97 | |
| Vidrio borosilicato | equipo | WPI | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse microscopio invertido | equipo | Nikon | TE2000U | Equipada con lámpara de Hg, filtro de GFP y objetivos de 20X y 5X al menos |
| Amplificador de PC-501A | equipo | Warner | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Diamond cuchillo | Equipo | Por encargo | ||
| Digitalizador Mikro1401 A / D | equipo | Cambridge Electronic Design | ||
| Filtrar unidad 3382 | equipo | Krohn Hite corporación | ||
| Señal | software | Cambridge Electronic Design | ||
| Moldeado de Ag / AgCl Pellet | equipo | WPI | 64-1297 | |
| Pipetear titular | equipo | Warner | 64-0997 | Custom modificado para ajustarse headstage |
| Grabación de cámara | Equipo | Por encargo | ||
| Micromanipulador MP85-1028 | equipo | Sutter Instrument | Micromanipulador MP85-1028 | |
| Aceite mineral | Solución | Sigma | 330779-1L | |
| Osciloscopio TDS 1001 | equipo | Tektronix | ||
| Tres de cañón tubo de vidrio cuadrado | Equipo | Warner | 64-0119 | 0,6 mm ID, 5 cm de largo |
| Válvula | equipo | La Compañía Lee | ||
| ValveLink 8,2 | equipo | Automatizar Científico | ||
| SF-77B perfusión rápido paso | equipo | Warner |
Referencias
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B. Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities. Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From pheromones to behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Kleene, S. J. The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia. Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).
- Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. Responses of retinal rods to single photons. J. Physiol. 288, 613-634 (1979).
- Wang, J., Kefalov, V. J. Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors. J. Vis. Exp. (35), e1681(2010).
- Lowe, G., Gold, G. H. The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 442, 147-168 (1991).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells. J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).
- Reisert, J., Matthews, H. R. Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells. J. Physiol. 519, 801-813 (1999).
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- Reisert, J., Matthews, H. R. Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells. J. Physiol. 535, 637-645 (2001).
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