Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

Resumen

En este artículo se describe una secuencia optimizada de eventos para obtener imágenes multimodal de los injertos celulares en el cerebro de los roedores por medio de: (i) en la bioluminiscencia in vivo y la resonancia magnética, y (ii) el análisis post mortem histológico. La combinación de estas modalidades de imágenes en un solo animal permite la evaluación del injerto celular con alta resolución, sensibilidad y especificidad.

Resumen

Durante la década pasada, el trasplante de células madre ha ganado un creciente interés como modalidad terapéutica primaria o secundaria para una variedad de enfermedades, tanto en estudios preclínicos y clínicos. Sin embargo, hasta la fecha los resultados con respecto a los resultados funcionales y / o regeneración de los tejidos después de un trasplante de células madre son muy diversas. Por lo general, un beneficio clínico que se observa, sin conocimiento profundo de los mecanismo (s) ^1. Por lo tanto, los múltiples esfuerzos han llevado al desarrollo de las diferentes modalidades de imágenes moleculares para controlar el injerto de células madre con el fin último de evaluar con precisión la supervivencia, el destino y la fisiología de las células madre injertadas y / o su entorno micro. Los cambios observados en uno o más parámetros determinados por imagen molecular podría estar relacionado con el efecto clínico observado. En este contexto, nuestros estudios se centran en el uso combinado de imágenes de bioluminiscencia (BLI), imágenes por resonancia magnética (RM) e histológicos analysis para evaluar el injerto de células madre.

BLI se utiliza comúnmente para no invasiva realizar el seguimiento de celda y vigilar la supervivencia celular en el tiempo después del trasplante ^2-7, basado en una reacción bioquímica en donde las células que expresan el gen de luciferasa-reportero son capaces de emitir luz siguiente interacción con su sustrato (por ejemplo, D- luciferina) ^{8, 9.} RM por otro lado es una técnica no invasiva que es aplicable clínicamente ¹⁰ y se puede utilizar para localizar con precisión los injertos celulares con una resolución muy alta ^11-15, aunque su sensibilidad depende en gran medida el contraste generado después de marcado de la célula con un agente de contraste para MRI . Por último, post mortem análisis histológico es el método de elección para validar los resultados de investigación obtenidos con técnicas no invasivas con mayor resolución y sensibilidad. Por otra parte punto final el análisis histológico nos permite realizar un análisis detallado fenotípica de las células injertadas y / o el tejido circundante, baSED en el uso de proteínas fluorescentes reportero y / o etiquetado directo de células con anticuerpos específicos.

En resumen, aquí visualmente demostrar la complementariedad de BLI, la resonancia magnética y la histología de desentrañar las células madre y diferente / o asociados con el medio ambiente las siguientes características injerto de células madre en el SNC de ratones. A modo de ejemplo, la médula ósea derivados de las células del estroma, la ingeniería genética para expresar la mayor proteína verde fluorescente luciferasa (eGFP) y Firefly (fluctuaciones), y marcado con color azul fluorescente micras de tamaño de partículas de óxido de hierro (MPIOs), serán injertados en el sistema nervioso central de ratones inmunocompetentes y los resultados serán monitoreados por BLI, la resonancia magnética y la histología (Figura 1).

Protocolo

1. Preparación de la célula

1. Los experimentos se debe iniciar con ex vivo de células madre cultivadas de poblaciones genéticamente modificadas para expresar las proteínas reportero luciferasa y eGFP. Aquí se utiliza luciferasa / eGFP expresando murinos derivados de médula ósea células del estroma (BMSC-Luc/eGFP) como se ha descrito por Bergwerf et al. ^{2, 5.}
2. Dos días antes de marcado de la célula, las células de la placa BMSC-Luc/eGFP a una densidad de 8 x 10 ⁵ células por matraz de cultivo T75 en 15 ml de medio de expansión completa (CEM), suplementado con 1 mg / ml Puromycine.
3. Permiten a las células a crecer durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO _2.
4. Añadir 5 x 10 ⁶ azul glacial micras de tamaño de partículas de óxido de hierro (GB MPIO) por medio de cultivo ml para el cultivo celular cada vez más (total: 75 x 10 ⁶ partículas por 15 ml de medio de cultivo en un frasco de cultivo T75).
5. Incubar durante 16 horas para permitir la captación de partículas a través de la endocitosis.
6. Eliminar las partículas que quedany permitir que las células crecen para un período adicional de 24 h para obtener la distribución de células confluencia y homogénea de la MPIO GB.
7. Validar la captación de partículas visualmente utilizando microscopía de fluorescencia, contando la relación de eGFP + y células MPIO GB + para la cantidad total de eGFP + en las células.
8. Lavar GB MPIO células marcadas BMSC-Luc/eGFP dos veces con 10 ml de PBS y las células después de la cosecha de tripsina-EDTA tratamiento (5 ml por matraz de cultivo T75 durante 5 minutos).
9. Lavar las células cosechadas y resuspender en concentración final de 133 x 10 ⁶ células / ml en PBS.
10. Mantener las células en hielo hasta el trasplante.

2. Implante celular en el SNC de ratones

1. Anestesiar ratones con una inyección intraperitoneal de una ketamina (80 mg / kg) + xilazina (16 mg / kg) mezcla.
2. Espere 5 minutos para permitir que los ratones para conciliar el sueño.
3. Afeitarse la cabeza del ratón para permitir manipulaciones estériles.
4. Coloque el ratón en un marco estereotáctico.
5. Desinfectar ella piel y la humedad de los ojos de los ratones para prevenir la deshidratación.
6. Haga una incisión del cuero cabelludo línea media para exponer el cráneo, y perfore un agujero en el cráneo con un taladro dental de rebabas en las coordenadas dadas: 2 mm por detrás y 2 mm lateral a Bregma.
7. La suspensión de células vórtice brevemente y aspirar la suspensión de células en la jeringa.
8. Colocar la aguja de la jeringa a una profundidad de 2,5 mm bajo la duramadre y permitir el equilibrio de presión durante 1 minuto.
9. Inyectar una suspensión de células 3 l (4 x 10 ⁵ células) a una profundidad de 2 mm por debajo de la duramadre y a una velocidad de 0,70 l / min utilizando un sistema automatizado de micro-inyección de la bomba.
10. Esperar 5 minutos adicionales para evitar el reflujo de la suspensión celular inyectada.
11. Poco a poco retraer la aguja y desinfectar las fronteras de la piel antes de suturar la piel.
12. Inyectar 300 l solución NaCl al 0,9% por vía subcutánea con el fin de evitar la deshidratación, y colocar el ratón bajo una lámpara de calentamiento para recuperarse de la anestesia. Administrar post-operatorio analgésico en conformidad con las normas institucionales.

3. En bioluminiscencia in vivo

1. Anestesiar los ratones por una mezcla de 3% de isoflurano y oxígeno.
2. Coloque los ratones en el reproductor de imágenes de fotones y reducir el nivel de la anestesia con isoflurano al 1,5% y el oxígeno.
3. Inyectar 150 mg de D-luciferina por kg de peso corporal por vía intravenosa.
4. Adquirir la imagen durante 5 minutos utilizando el software de visión de fotos.
5. Lleve a cabo el procesamiento de imágenes utilizando el software M3vision. Cuantificar la señal observada con las regiones de interés fijas.

4. En vivo de imágenes de resonancia magnética

1. Anestesiar los ratones con 3% de isoflurano en una mezcla de O _2: N ₂ O (3:7).
2. Coloque los ratones en la inmovilización de un sistema horizontal 9.4T MR y reducir el nivel de anestesia a 1% de isoflurano en una mezcla de O _2: N ₂ O (3:7).
3. Humedezca los ojos de los ratones para evitar la deshidrataciónción, conecte una sonda rectal para controlar la temperatura corporal y controlar la tasa de respiración mediante la colocación de un sensor debajo del vientre del ratón.
4. Mantener la tasa de respiración a 110 ± 10 respiraciones por minuto y mantener la temperatura corporal constante dentro de un estrecho rango de 37 ± 0,5 ° C.
5. Colocar la bobina de RF en la superficie superior de la cabeza del ratón y la posición del ratón en el centro del imán.
6. Adquirir un conjunto de 10 coronales potenciadas en T2 eco del espín (SE) en las imágenes para obtener información específica anatómica y T2 * imágenes de eco de gradiente (GE) con el fin de estudiar la migración de células madre con una resolución en el plano de 70 m ^2. Establezca los parámetros de la secuencia de la siguiente manera: tiempo de repetición (TR): 500 ms, tiempo de eco (TE): 8 ms (secuencia GE) y el tiempo de repetición (TR): 4200 ms, tiempo de eco (TE): 12,16 m (SE secuencia); campo de visión (FOV): 18x18 mm ^2, la matriz: 256x256, un grosor de corte mm y una separación de corte mm (5,1 Paravision de software).
7. Lleve a cabo el procesamiento de datosutilizando el software Amira 4.0.

5. Post Mortem Histología

1. Anestesiar los ratones muy profundamente por la inhalación de un oxígeno isofluorano (4%), (0,5 l / min) y nitrógeno (1 l / min) mezcla durante 2 minutos. El sacrificio de los ratones por dislocación cervical.
2. Retire el cerebro del ratón en el cráneo y fijar el tejido cerebral en paraformaldehído al 4% en PBS durante 2 horas.
3. Deshidratar el tejido cerebral mediante la colocación del cerebro posteriormente en diferentes gradientes de sacarosa: 2 horas en 5% de sacarosa en PBS, 2 h en 10% de sacarosa en PBS, durante toda la noche en 20% de sacarosa en PBS.
4. Congelar el tejido cerebral utilizando nitrógeno líquido y almacenar el tejido a -80 ° C hasta que el corte.
5. Sección del tejido cerebral en 10 secciones m de espesor con un criostato.
6. Pantalla sin mancha cryosections de fluorescencia azul de las partículas GB MPIO y la fluorescencia verde de las células que expresan eGFP utilizando un microscopio de fluorescencia.
7. Pantalla sin mancha de cryosectionsverde / rojo de fondo de fluorescencia de las células inflamatorias.
8. Realizar tinciones inmunohistoquímicas y de inmunofluorescencia más para identificar las poblaciones endógenas de células (por ejemplo, la microglia, astrocitos, células T, ...) que interactúan con los injertos celulares.

6. Los resultados representativos

Estamos aquí presentada visualmente una secuencia optimizada de eventos para el éxito de imagen multimodal de las poblaciones de luciferasa / eGFP célula que expresa (STEM) en el sistema nervioso central de ratones. Al principio, los que se describen GB MPIO los resultados del procedimiento de etiquetado en los alimentos de alta eficiencia de las células BMSC-Luc/eGFP, que fácilmente pueden ser validados mediante microscopía de fluorescencia (Figura 2A). A continuación, sobre el injerto de GB MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP en el SNC de ratones, la supervivencia del injerto celular puede ser controlado por in vivo BLI basado en la actividad de luciferasa (Figura 2B). Además, la localización exacta de las células injertadas pueden ser controlados por in vivo (Figura 2C). Finalmente, el análisis histológico permite la validación de los resultados obtenidos por BLI y RMN. Estable la supervivencia fue confirmada por un eGFP expresión estable en el tiempo (Figura 2). Para esto, colocalización de eGFP-expresión de las células con azul fluorescente MPIO permite la determinación exacta de la localización y la supervivencia de las células injertadas. Además, este doble etiquetado fluorescente de las células madre reduce la posibilidad de observar resultados positivos falsos basados ​​en fluorescencia de fondo creado por las células inflamatorias ^5.

Figura 1. Visión general de la secuencia de manejo

1. Etiquetado de la célula: BMSC-Luc/eGFP están etiquetados con 5 x 10 ⁶ partículas GB MPIO por medio de cultivo ml. Después de 16 horas de incubación y un período de descanso de la siguiente 24 horas, las células se cosechan parala implantación intracerebral.
2. Implantación de las células: GB MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP se injertan en el cerebro de ratones en las siguientes coordenadas: bregma -2 mm, 2 mm de la derecha de la línea media y 2 mm en la duramadre.
3. En vivo BLI: Después de la administración intravenosa de 150 mg D-luciferin/kg peso corporal, la luz generada fue adquirida durante 5 minutos usando el reproductor de imágenes de fotones.
4. En vivo RM: Un conjunto de 10 coronales potenciadas en T2 eco del espín (SE), las imágenes y T2 * imágenes eco de gradiente (GE) con una resolución en el plano de 70 m ² fueron adquiridas. Parámetros de la secuencia fueron los siguientes: tiempo de repetición (TR): 500 ms, tiempo de eco (TE): 8 ms (secuencia GE) y el tiempo de repetición (TR): 4200 ms, tiempo de eco (TE): 12,16 m (secuencia SE); campo de visión (FOV): 18x18 mm ^2, la matriz: 256x256, un grosor de corte mm y 1 mm de separación corte.
5. La histología post-mortem: criosección 10μm de espesor fueron seleccionados para expresar eGFP y azul marcado con fluorescencia u BMSCcantar un microscopio de fluorescencia.

Figura 2. Multimodal de imágenes de los injertos de células madre

1. Microscopio de inmunofluorescencia directa de azul glacial (GB) MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP.
2. En vivo BLI de los ratones inyectados con 4x10 ⁵ GB MPIO células marcadas BMSC-Luc/eGFP en la semana 1 y 2 semanas después de la implantación. El análisis estadístico de las señales detectadas de BLI en la semana 1 y 2 semanas después de la implantación. Los datos se expresan como el número promedio de fotones por segundo por estereorradián por centímetro cuadrado (ph / s / sr / cm ²⁾ a partir de un período de tiempo de 5 minutos + / - error estándar calculado a partir de una región de interés fijo en ratones que muestran una clara señal de BLI en el sitio de inyección.
3. Coronal de dos dimensiones de la resonancia magnética GB MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP (a la izquierda del panel: (i) en T2 la imagen eco de espín y (ii) T2 * imagen de eco de gradiente) y sin etiqueta BMSC L-UC / eGFP (panel de la derecha: (iii) la imagen ponderada en T2 eco de espín y (vi) T2 * imagen de eco de gradiente) injertos en el cerebro del ratón.
4. El análisis histológico de los implantes GB MPIO etiquetados BMSC-Luc/eGFP en la semana 2 post-implantación. (I) el análisis de inmunofluorescencia directa para la localización de eGFP de expresar y GB MPIO etiquetados injertos BMSC-Luc/eGFP. (Ii) los detalles a gran aumento de (i). (Iii) la tinción de inmunofluorescencia para el antígeno de GFAP, lo que indica el desarrollo de tejido cicatrizal los astrocitos en los alrededores de la etiqueta BMSC-Luc/eGFP GB MPIO. (Vi) la tinción de inmunofluorescencia para el antígeno de Iba-1, lo que indica la invasión y los alrededores de GB MPIO BMSC-Luc/eGFP etiquetados por la microglia.

Discusión

En este reporte se describe un protocolo optimizado para la combinación de tres técnicas de imagen complementarias (BLI, la resonancia magnética y la histología) para la caracterización detallada de los implantes celulares en el sistema nervioso central de ratones inmunes competentes. Una combinación de etiquetado del gen de las células, sobre la base de la modificación genética con los genes reporteros de luciferasa de luciérnaga y eGFP, y un etiquetado directo de células con GB MPIO, conduce a una evaluación precisa d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
IMDM	Lonza	BE12-722F	Componente de la CEM, el medio de cultivo celular
Suero bovino fetal	Gibco	10270-106	Componente de la CEM, el medio de cultivo celular
El suero de caballo	Gibco	1605-122	Componente de la CEM, el medio de cultivo celular
La penicilina-estreptomicina	Gibco	15140	Componente de la CEM, el medio de cultivo celular
Fungizone	Gibco	15290-018	Componente de la CEM, el medio de cultivo celular
PBS	Gibco	14190
Puromycine	Invivogen	ANT-PR-1
tripsina	Gibco	25300
GB MPIO	Bangs Laboratorios	ME04F/7833
D-luciferina	Promega	E1601
La ketamina (Ketalar)	Pfizer
Xilazina (Rompun)	Bayer Health Care
El isoflurano	Isoflo	05260-05
0,9% de NaCl solución	Baxter
paraformaldehído	Merck	1.04005.1000
sacarosa	Applichem	A1125
Micro-bomba de inyección	KD científica	KDS100
Photon imágenes	Biospace Lab
9.4T MR escáner	Bruker BioSpin	Biospec 94/20 USR
BX51	Olimpo	BX51
Mycrom HM criostato	Prosan	HM525
jeringa	Hamilton	7635-01
Aguja de calibre 30	Hamilton	7762-03
Foto Visión de software	Biospace Lab
M3vision de software	Biospace Lab
Paravision 5.1 del software	Bruker BioSpin
Amira software 4.0	Visage imágenes