Artículo de método

Seguimiento de los cambios en la concentración de calcio intracelular y la eficacia sináptica en el molusco

DOI:

10.3791/3907

⸱

15 de julio de 2012

 ,  , 
1Fishberg Department of Neuroscience and Friedman Brain Institute, Mt. Sinai School of Medicine, 2Phase Five Communications Inc.

En este artículo

Resumen

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Se demuestra cómo los cambios en la concentración de calcio libre intracelular y la eficacia sináptica puede controlarse simultáneamente en una preparación de ganglio Aplysia. Nosotros imagen calcio intracelular usando un colorante fluorescente, naranja calcio, e inducir y controlar la transmisión sináptica con afilados (intracelular) electrodos.

Resumen

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Se ha sugerido que los cambios en el calcio intracelular mediar la inducción de un número de importantes formas de plasticidad sináptica (por ejemplo, facilitación, homosináptica) 1. Estas hipótesis pueden ser probadas por monitorizar simultáneamente los cambios en el calcio intracelular y alteraciones en la eficacia sináptica. Se demuestra cómo esto se puede lograr mediante la combinación de imágenes de calcio con técnicas de grabación intracelulares. Nuestros experimentos se llevan a cabo en un ganglio vestibular del molusco Aplysia californica. Esta preparación tiene una serie de características ventajosas experimentalmente: Ganglios puede ser fácilmente eliminado de Aplysia y experimentos utilizar neuronas adultas que hacen conexiones sinápticas normales y tienen una distribución de canales de iones normal. Debido a la baja tasa metabólica del animal y las temperaturas relativamente bajas (14-16 ° C) que son naturales para Aplysia, preparaciones son estables durante largos períodos de tiempo. ent "> Para detectar cambios en el calcio libre intracelular que utilizaremos la versión celular de calcio impermeant Orange 2, que es fácilmente 'cargado' en una neurona a través de iontoforesis. Cuando este tinte fluorescente de longitud de onda larga se une al calcio, aumenta la intensidad de fluorescencia. calcio Orange tiene propiedades cinéticas rápidas 3 y, a diferencia de los tintes proporcional (por ejemplo, la Fura 2), no requiere rueda de filtros para imágenes. Es bastante estable y menos foto fototóxica que otros colorantes (por ejemplo, fluo-3) 2,4. Al igual que todos los no-radiométrico colorantes, Calcium Orange indica cambios relativos en la concentración de calcio. Pero, debido a que no es posible tener en cuenta los cambios en la concentración de colorante debido a la carga y difusión, no puede ser calibrado para proporcionar concentraciones absolutas de calcio.

Una posición vertical, fijo microscopio etapa, el compuesto se utilizó para las neuronas de imagen con una cámara CCD capaz de grabar alrededor de 30 fotogramas por segundo. En Aplysia esta resolución temporales más que suficiente para detectar incluso un único pico de la alteración inducida en la concentración de calcio intracelular. Electrodos afilados se utilizan simultáneamente para inducir y registrar la transmisión sináptica en las neuronas identificadas pre y postsinápticos. Al final de cada ensayo, un script personalizado combina electrofisiología y los datos de imagen. Para asegurar la sincronización adecuada se utiliza un pulso de luz de un LED montado en el puerto de la cámara del microscopio. La manipulación de los niveles de calcio presinápticos (por ejemplo, mediante inyección intracelular EGTA) nos permite poner a prueba hipótesis específicas, en relación con el papel del calcio intracelular en la mediación de las distintas formas de plasticidad.

Protocolo

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1. Preparación

  1. Se anestesia el animal mediante la inyección de 75-100 ml de solución isotónica de cloruro de magnesio. El Aplysia que utilizamos para formación de imágenes son generalmente 150-200 gramos y se obtienen a partir Marinus Scientific.
  2. Pin el animal anestesiado a un plato cubierto de cera. Agujas de jeringa funcionan bien para este propósito; técnicas estériles no son necesarios. Con unas pinzas y tijeras brutos estándar hacen una incisión en la pata del animal y exponer la masa bucal. Localice el ganglio vestibular. Con unas tijeras y pinzas de resorte fino, cuidadosamente gratis el ganglio cortando todos los nervios vestibul....

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Discusión

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Demostramos técnicas que se pueden utilizar para monitorear simultáneamente la concentración de calcio intracelular y evaluar la eficacia de la transmisión sináptica. Estas técnicas son útiles para determinar cómo las diversas formas de plasticidad a corto plazo están mediadas.

La formación de imágenes se lleva a cabo con un microscopio de fluorescencia y cámara CCD. Estos requerimientos de equipo son relativamente modestos en comparación a la mayoría de neuroimagen funcional set-ups. La téc.......

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Divulgaciones

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No tenemos nada que revelar.

Agradecimientos

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A Grant PHS (MH51393) apoya este trabajo. Algunos de los Aplysia que utilizamos son proporcionados por el Nacional de Recursos para Aplysia, de la Universidad de Miami con la subvención RR10294 del Centro Nacional para Recursos de Investigación, NIH.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentario
Calcio Orange Invitrogen C-3013
EGTA Sigma E-4378
Calibración de calcio tampón kit Invitrogen C-3008MP útil para probar la sensibilidad y el rango dinámico de la señal
Magnesio hexahidrato de cloruro Sigma M0250 utilizado en solución 0,33 M de anestesiar a los animales

Reactivos Tabla 1. Utilizado.

Nombre del equipo Empresa Comentario
FN-1 microscopio de fluorescencia vertical Nikon Instruments con Narishige ITS-FN1 etapa
NMN-21 manipuladores Narishige montado en el escenario con imanes
CoolSNAP HQ 2 CCD cámara Fotometría
NIS elementos AR
(Versión 3.22) 		Nikon Instruments software de imágenes utilizados para adquirir datos de fluorescencia
10X/0.3w Plan Fluor objetivo Nikon Instruments esta lente de inmersión en agua tiene una muy larga distancia de trabajo de 3,5 mm
X-Cite 120 lámpara de halogenuro metálico PC EXFO utilizado para las imágenes por fluorescencia
LS-DWL
lámpara halógena 		Sumica
ET-CY3 Juego de filtros Tecnología Chroma ;
Poder 1401 convertidor A / D Cambridge Electronic Design se realizaron muestreos de 3 kHz
Espiga II
(Versión 7.07) 		Cambridge Electronic Design software utilizado para adquirir datos de electrofisiología
SEC-10 LX amplificador NPI electrónica se utiliza con un headstage 10 veces
Modelo 410 amplificador Brownlee precisión utilizados para amplificar y filtrar la señal
WS-4 menos k Tecnología aislamiento de vibraciones para formación de imágenes
mesa de enfriamiento encargo placa de latón a través del cual se bombea agua de hielo a una tasa variable

Tabla 2. Equipo utilizado.

Referencias

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  1. Zucker, R. S., Regehr, W. G. Short-term synaptic plasticity. Annu. Rev. Physiol. 64, 355-405 (2002).
  2. Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res.....

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