La identificación y aislamiento de Slow división de las células de glioblastoma humano utilizando carboxi fluoresceína Succinimidyl Ester (CFSE)

Resumen

Este protocolo de video demuestra la aplicación de el colorante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) para la identificación y separación de los diferentes sub-poblaciones de células de glioblastoma humano en base de la frecuencia de la división celular.

Resumen

Heterogeneidad tumoral representa una característica fundamental de apoyo robustez tumor y presenta un obstáculo fundamental para el desarrollo de estrategias terapéuticas ^1. Para superar el problema de la heterogeneidad del tumor, es esencial para desarrollar ensayos y herramientas que permiten fenotípica, (epi) la identificación genética y funcional y la caracterización de las subpoblaciones tumorales que conducen a enfermedades y patologías específicas representan objetivos clínicamente relevantes. Actualmente está bien establecido que los tumores presentan distintas sub-fracciones de células con diferentes frecuencias de la división celular, y que los criterios funcionales de ser lento bicicleta está positivamente asociado con la capacidad de formación de tumores en varios tipos de cáncer, incluidos los del cerebro, mama, piel y páncreas, así como leucemia ^2-8. El colorante fluorescente carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) se ha utilizado para el seguimiento de la frecuencia de división de las células in vitro e in vivo en transmisión sanguínea tumors y tumores sólidos tales como el glioblastoma ^2,7,8. La célula-permeante no fluorescente pro-fármaco de la CFSE se convierte mediante esterasas intracelulares a un compuesto fluorescente, la cual es retenida dentro de las células por unión covalente a las proteínas mediante la reacción de su radical succinimidilo con grupos amina intracelulares para formar enlaces amídicos estables ^9. El tinte fluorescente se distribuye por igual entre las células hijas a divisiones, llevando a la reducción a la mitad de la intensidad de la fluorescencia con cada división celular. Esto permite realizar un seguimiento de la frecuencia del ciclo celular hasta ocho a diez rondas de división ^10. Capacidad de retención de CFSE se utilizó con las células tumorales del cerebro para identificar y aislar una subpoblación bicicleta lenta (parte superior 5% de retención de colorante células) demostraron ser enriquecido en actividad de células madre de cáncer ^2.

Este protocolo describe la técnica de tinción de las células con CFSE y el aislamiento de las poblaciones individuales dentro de una cultura de humano glioblastoma (GBM)-derivados de células que poseen diferentes tipos de división usando citometría de flujo ^2. La técnica ha servido para identificar y aislar un tumor cerebral lento bicicleta población de células en virtud de su capacidad para retener la CFSE etiquetado.

Protocolo

1. Preparación de la suspensión Glioblastoma Single Cell

1. Cultura Gliomasphere se establece y mantiene usando el ensayo de neurosphere (NSA) como se ha descrito previamente ^2,11,12.
2. En el momento apropiado para pasar las gliomaspheres, el medio que contiene las esferas se retira, se colocaron en un tubo estéril de tamaño apropiado de cultivo de tejidos, y se centrifugaron a 800 rpm (110 g) durante 5 min a temperatura ambiente.
3. El sobrenadante se desechó y el sedimento de esferas se resuspendieron en 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA y se incubó a 37 ° C en un baño de agua durante 3-5 min.
4. Un volumen igual de inhibidor d....

Discusión

Un creciente número de estudios han demostrado la importancia de una lenta dividiendo sub-compartimiento de células en el cáncer que contribuyen a la formación de tumores y la resistencia al tratamiento ^2-8. Por lo tanto es crítico para describir y estandarizar los métodos experimentales que permiten el estudio de esta subpoblación específica de células o de manera más general para comparar las subpoblaciones con diferentes tasas de crecimiento. Usando CFSE para identificar y aislar sub-fracciones de las célu.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Tipo	Empresa	Número de catálogo
NeuroCult NSC Basal Medium (Humana)	Medio	Stem Cell Technologies	05750
NeuroCult NSC proliferación Suplementos (Humana)	Suplemento Media	Stem Cell Technologies	05753
0,05% de tripsina-EDTA	Reactivo	Gibco	25300-062
Inhibidor de tripsina de soja	Reactivo	Sigma	T6522
Penicilina / Estreptomicina	Reactivo	Gibco	15140-122
Matraz T25	Cultura cerámica	Nalge Nunc internacional	136196
T80 frasco	Cultura cerámica	Nalge Nunc internacional	178905
15 ml tubos	Cultura cerámica	BD Falcon	352096
50 ml tubos	Cultura cerámica	BD Falcon	352070
FEAG	Factor de crecimiento	De I + D	2028-EG
CFSE CellTrace Proliferación Celular Kit	División Celular fluorescente seguimiento Dye	Molecular Probes, Invitrogen	C34554