A pesar de los esfuerzos en curso a las culturas de transición a la alimentación libre de condiciones, la derivación y la cultura de células madre embrionarias humanas (hESC) siguen siendo en gran parte dependiente en co-cultivos con alimentadores de embriones de ratón (MEFs). A continuación, se muestra una nueva metodología para la rápida eliminación de los alimentadores a partir de cultivos celulares de grado terapéutico antes de la experimentación.
Artículo de método
La eliminación rápida de fibroblastos de alta densidad Humanos culturas de células madre embrionarias
En este artículo
Resumen
Resumen
Fibroblastos de embriones de ratón (MEFs) se utilizaron para establecer células madre embrionarias humanas (hESCs) los cultivos tras el aislamiento de blastocisto 1. Este sistema de alimentación mantiene hESCs de someterse a la diferenciación espontánea durante la expansión celular. Sin embargo, este método de co-cultivo es laborioso, requiere de personal altamente capacitado y pureza rendimientos hESC bajo 4. Muchos laboratorios han intentado reducir al mínimo el número de células de alimentación en cultivos de células madre (es decir, la incorporación de la matriz platos recubiertos o otros tipos de células alimentadoras 5-8). Estos sistemas de cultivos modificados han mostrado cierta promesa, pero no han suplantado el método estándar para el cultivo de hESCs con mitomicina C tratados con fibroblastos de ratón embrionaria, con el fin de retardar la diferenciación espontánea no deseada de los cultivos de células madre. Por lo tanto, las células de alimentación utilizados en la expansión de células madre debe ser removido durante experimentos de diferenciación. Aunque se dispone de varias técnicas para purificar el co hESClonies (FACS, Mac, o el uso de vectores resistentes a los fármacos) de los alimentadores, estas técnicas son mano de obra intensiva, costosa y / o contrarios a la hESC. El objetivo de este proyecto era inventar un método de purificación que permite la recolección de una población pura de hESCs. Hemos observado que en un cultivo confluente hESC, la población MEF se puede eliminar mediante una aspiración simple y rápido de la hoja de MEF. Esta eliminación es dependiente de varios factores, incluyendo lateral de célula a célula de unión de MEFs que tienen una menor afinidad de unión a la placa de cultivo de estireno, y la capacidad de las colonias de células madre para empujar los fibroblastos hacia el exterior durante la generación de su propio " nicho ". El hESC fueron examinados por SSEA-4, Oct3 / 4 y expresión Tra 1-81 hasta 10 días después de la eliminación del MEF para asegurar el mantenimiento de la pluripotencia. Por otra parte, las colonias de células madre fueron capaces de continuar creciendo en grandes formaciones de después de la eliminación MEF, que proporciona un nivel adicional de expansión hESC.
Protocolo
1. Preparación de los Alimentadores de embriones de ratón
- El MEFs utilizado en el co-cultivo de hESCs debe ser previamente tratada por irradiación o mitomicina C para inhibir las células de sufriendo división.
- Dos horas antes de la siembra MEF, bata de cada plasma de 60 mm placa de cultivo tratado con 2 ml de gelatina al 0,05%.
- Descongelar un vial de MEFs tratada y placas a ~ 20.000 células / cm 2.
- Permitir que las células se adhieran durante la noche.
2. Siembra Co-hESCs en MEFs
- Las nuevas colonias se puede iniciar a partir de cultivos crioconservados o pases culturas actuales sobre nuevos MEF platos recubiertos, como a continuación.
- Lavar la placa que contiene las colonias hESC grandes para ser pasadas 1 hora con 3 ml de PBS 1x calentado.
- Añadir 3 ml de colagenasa IV / solución de PBS (1 mg / ml), y se incuba durante 5-10 minutos a 37 ° C. (Nota: Las células no se harán distintos o balón como se ha visto con tripsina).
- Mientras que las células están todavía en lacolagenasa, utilizar un borde de una punta de pipeta de 5 ml, crear un patrón de rejilla en las colonias, romper en pequeños grupos de células.
- Con la punta de la punta de la pipeta (realizado de una manera perpendicular a la placa de cultivo) para raspar el fondo de la placa de cultivo, desplazando todas las células de la superficie.
- Recoger las células en un tubo Falcon y giran a (1000 rpm) durante 5 min.
- Después de la centrifugación, se aspira el medio, dejando el sedimento de células en el tubo Falcon.
- Aspirar el medio desde el MEF MEFs chapado en el día antes.
- Re-placa las células a una proporción de 1:3 de la placa original, y se alimentan con 3 ml de medio de hESC
3. Agotan MEFs de la Co-cultura
Nota: Humanos culturas ESC debe ser a alta densidad, por lo general entre 10 y 14 días de cultivo.
- Colocar la punta de una pipeta de aspiración en el borde de la placa y permitir la succión para tirar suavemente hasta el borde de la hoja de MEF.
- ReMove los medios de comunicación de la antena, y permita que la punta para coger la capa celular y mueva lentamente la punta de forma arqueada por encima de la placa. Nota: La hoja puede atascar en la punta de la pipeta, pero esto no es problemático ya que no debe impedir que el usuario manualmente tirando de la hoja de la superficie de la placa de cultivo. Si las células están pegados a la final del aspirador, puede usar la parte superior de la placa de cultivo para romper la lámina de células para la aspiración completa.
- Reemplace inmediatamente hESC medio, y poner la placa en la incubadora.
4. Los resultados representativos
El resultado final del proceso de eliminación MEF produce pequeñas colonias hESC inalteradas (Figura 1D) capaces de someterse a la expansión significativa en colonias muy grandes (Figura 2) mientras se mantiene la expresión de los fabricantes de pluripotencia SSEA-4, octubre ¾, y TRA 1-81 (figura 3).
Figura 1. ESC morfología de las colonias antes y después de la extracción MEF. Humanos colonias de células madre embrionarias en un día) 1 y B) el día 2 después de la siembra en placas de cultivo. C) de alta densidad Humanos colonias de células madre embrionarias (H7), rodeada de MEFs. Las dos colonias hESC se describen en rayas rojas. D) Después de la eliminación MEF mediante la técnica de aspiración descrito, nos quedamos con una colonia de células madre aisladas con muy pocos MEFs que rodea la colonia intacta.
Figura 2. Expansión ESC Colonia 10 días después de la extracción MEF. HESC La colonia original inmediatamente después de agotamiento MEF (izquierda) se le permite expandirse en una colonia muy grande (derecha) aproximadamente 800 micras, 10x. Tenga en cuenta que la colonia original se forma la imagen con el mismo aumento (10x) como la colonia compuesto.
Figura 3. La inmunotinción de las colonias hESC MEF-agotado. Identificación por inmunofluorescencia de las colonias de hasta 10 días después del agotamiento MEF demuestra que las colonias de mantener su expresión de marcadores de pluripotencia como evidente por octubre ¾, SSEA-4, y la tinción de Tra-1-81. Además, estas colonias de células madre no muestran diferenciación hacia un destino mesodérmico, indicado por la ausencia de Flk-1. A, E, I, y M) son imágenes de transmisión de luz de las colonias immunoflouscently manchadas, 20, 10, 10 y 2x, . respectivamente B, F, J y N) mostrar los núcleos -. células teñidas con DAPI de las colonias immunofluorescently manchadas, 20, 10, 10 y 2x, respectivamente CD) muestran la expresión demarcador de células madre humanas SSEA-4 solamente, y la imagen compuesta, 20x. GH) muestran la expresión de células madre humano octubre marcador ¾ sólo, y la imagen compuesta, KL 10x.) muestran la expresión de marcadores de células madre humanas Tra 1-81 sólo y la imagen compuesta, 10x. MP) La última fila si las imágenes muestran una colonia retratar las fronteras típicas liso visto con este aumento, 2x, y estas colonias no expreso O) Flk-1, un marcador temprano de la diferenciación del mesodermo, ni que P) contiene fibroblastos como se muestra por la ausencia de tinción de DDR2.
Vídeo Suplementario. Extracción de fibroblastos por aspiración de planos. Haga clic aquí para ver la película .
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Discusión
El método presentado en este manuscrito ofrece una alternativa rápida y menos costosa para la eliminación de células alimentadoras de fibroblastos humanos de cultivos de células embrionarias. La eliminación exitosa de los fibroblastos es dependiente de la existencia de una monocapa confluente herméticamente de estas células que se desarrolla en más cultivos de células madre. Después de 7-10 días, las colonias que crecen hESC empujará los fibroblastos de conexión en una dirección hacia fuera, la generación de una monocap...
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por una Nueva Facultad II Premio del Instituto de Medicina Regenerativa de California (RN2-00921-1), y un premio financiado por los NIH de Investigación Nacional (F32-HL104924)
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Fibroblastos Marker |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Núcleo Celular Marker |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | Human ESC Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | Human ESC Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Marcador de diferenciación temprana |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | Human ESC Marker |
Tabla 1. Tabla de razones específicascaballeros utilizada para la inmunotinción hESC.
Referencias
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
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- Stein, G. S. Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).
- Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.
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