Aquí se describe un método para el aislamiento, cultivo y manipulación de páncreas de ratón embrionario. Esto representa un excelente Ex vivo Sistema para el estudio de diversos aspectos del desarrollo pancreático, incluyendo la morfogénesis, la diferenciación y el crecimiento. Explantes pancreáticos brote pueden cultivarse durante varios días y se utiliza en una serie de aplicaciones diferentes, incluyendo todo el montaje de inmunofluorescencia y de imágenes en directo.
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Resumen
Resumen
El páncreas controla las funciones vitales de nuestro cuerpo, incluyendo la producción de enzimas digestivas y la regulación de los niveles de azúcar en la sangre 1. Aunque en la última década, muchos estudios han contribuido a una base sólida para la comprensión de la organogénesis pancreática, persisten importantes lagunas en nuestro conocimiento de la formación de páncreas temprano 2. Una comprensión completa de estos eventos tempranos proporcionará información sobre el desarrollo de este órgano, sino también en enfermedades incurables que se dirigen el páncreas, tales como la diabetes o el cáncer de páncreas. Finalmente, esta información se generará un modelo para el desarrollo de terapias de reemplazo de células en el contexto de la diabetes.
Durante la embriogénesis, el páncreas se origina en distintas derivaciones embrionarias endodermo del intestino anterior dorsal y ventral en el día embrionario (E) 9,5 en el embrión de ratón 3,4. Ambos crecimientos evaginar en el mesénquima circundante como sólido epiteliosyemas L, que se someten a la proliferación, diferenciación y de ramificación para generar un órgano completamente maduro 2,5,6. Evidencias recientes han sugerido que el crecimiento y la diferenciación de los linajes de células pancreáticas, incluyendo los que producen insulina-β-células, depende adecuada de tejido arquitectura, remodelación epitelial y posicionamiento de células en el epitelio pancreático ramificación 7,8. Sin embargo, como la morfogénesis de ramificación se produce y se coordina con la proliferación y diferenciación en el páncreas es en gran parte desconocida. Esto es en parte debido al hecho de que el conocimiento actual sobre estos procesos de desarrollo se ha basado casi exclusivamente en el análisis de muestras fijadas, mientras que los eventos morfogenéticos son muy dinámicas.
Aquí, se presenta un método para la disección y el ratón cultivo de brotes de páncreas embrionario ex vivo en los platos inferiores de cristal, que permiten la visualización directa del desarrollo del páncreas (Figura 1). Este cultoure sistema está idealmente diseñado para la microscopía confocal de barrido láser y, en particular, de células vivas de imágenes. Explantes pancreáticos se pueden preparar no sólo a partir de embriones de ratón de tipo salvaje, sino también a partir de cepas de ratones genéticamente modificados (transgénicos o knockout por ejemplo), lo que permite estudios en tiempo real de fenotipos mutantes. Además, este sistema de cultivo ex vivo es valiosa para estudiar los efectos de los compuestos químicos en el desarrollo de páncreas, lo que permite obtener datos cuantitativos sobre la proliferación y el crecimiento, la elongación, la ramificación, tubulogénesis y diferenciación. En conclusión, el desarrollo de un método in vivo de páncreas ex explante cultura combinada con imágenes de alta resolución proporciona una sólida plataforma para la observación de los eventos morfogenéticos y la diferenciación que se producen en el embrión de ratón en desarrollo.
Protocolo
El protocolo descrito aquí es una adaptación de la técnica originalmente descrita en Percival y Slack 9 y optimizado para la microscopía confocal.
1. Recubrimiento de platos de cristal cultivo de fondo
Los siguientes pasos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar.
- Explantes pancreáticos se cultivan en 35-mm placas de Petri con 20-mm de diámetro con fondo de vidrio micropocillo (por ejemplo MatTek Corporation). Use un plato con fondo de cristal por explante cultura y para toda la duración del cultivo. En el día antes de la disección y el aislamient....
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Discusión
Una vez que el destino de páncreas se especifica, las células progenitoras de páncreas experimentan una proliferación extensa, la diferenciación y la morfogénesis para formar finalmente un órgano funcional madura y 2,4. En la actualidad, la forma de ramificación tiene lugar en el páncreas y cómo está conectado a la proliferación y diferenciación de progenitor es en gran parte desconocida. Cultivos de explantes pancreáticos representan un sistema ideal para aclarar estos procesos ex vivo 5,9,11.<.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Investigación en el laboratorio Spagnoli. es un proyecto financiado por la Asociación Helmholtz, subvención del 7 º PM-IRG-2008-ENDOPANC y ERC-2009-Starting Grant hepatopáncreas.
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Materiales
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Anticuerpos: La carboxipeptidasa E-cadherina F-actina El glucagón Insulina β1-integrina Pdx1 Pdx1 Fosfato histona H3 | AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Banco hibridoma Señalización Celular | 1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706 | |
| Basal Medium Eagle (BME) | Sigma | B1522-500ML | Se mantuvo en condiciones estériles |
| Cultivo de células agua de calidad | PAA | S15-012 | Se mantuvo en condiciones estériles |
| Las placas de cultivo (con fondo de cristal), de 35 mm | MatTek Corporación | P35G-0-20-C | |
| Burro Suero | Chemicon | S30-100 ml | |
| Suero de ternero fetal Oro | PAA | A15-151 | Se mantuvo en condiciones estériles |
| La fibronectina | Invitrogen | 330100-8 | Stock sol. 1 mg / ml en agua de grado de cultivo celular |
| Gentamicina | Invitrogen | 15750-037 | Se mantuvo en condiciones estériles |
| Glutamina | Invitrogen | 25030-024 | Se mantuvo en condiciones estériles |
| 4-así multiplacas | Nunc | 176740 | |
| Microscopios: Microscopio Confocal invertido (LSM 700) Estereomicroscopio (Discovery V12) | Zeiss Zeiss | Objetivos: C-Apochromat 10x / 0,45 W M27 (trabajo. dist 1,8 mm;. Profundidad de imagen ~ 100 mm); C-Apochromat 40x / 1,2 W Corr. M27 (trabajo. dist 0,28 mm;. ~ Profundidad de imagen 50 micras) La transiluminación de abajo y la iluminación de fibra óptica desde arriba | |
| Paraformaldehído | Roth | 0335.3 | De la solución al 20% |
| Pasteur Pipeta (Glass), 150 mm | VWR | HECH567 / 1 | |
| Penicilina / Estreptomicina | PAA | P11-010 | Se mantuvo en estéril condiciones |
| Placas de Petri de 60 mm | Greiner Bio-One | 628102 | |
| Placas de Petri, 35 mm | Greiner Bio-One | 627161 | |
| 1X PBS, pH 7,4 | PAA | H15-002 | Se mantuvo en condiciones estériles |
| Spring Tijeras 8 mm cuchilla curvada | Herramientas Artes Ciencias | 15023-10 | |
| Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| Relojería foreceps Dumont # 5 | Roth | K342.1 |
Referencias
- Slack, J. Developmental biology of the pancreas. Development. 121, 1569-1580 (1995).
- Pan, F., Wright, C. Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland. Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).
- Puri, S., Hebrok, M.
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Reimpresiones y permisos
