Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

Resumen

Aquí se describe un método para el aislamiento, cultivo y manipulación de páncreas de ratón embrionario. Esto representa un excelente Ex vivo Sistema para el estudio de diversos aspectos del desarrollo pancreático, incluyendo la morfogénesis, la diferenciación y el crecimiento. Explantes pancreáticos brote pueden cultivarse durante varios días y se utiliza en una serie de aplicaciones diferentes, incluyendo todo el montaje de inmunofluorescencia y de imágenes en directo.

Resumen

El páncreas controla las funciones vitales de nuestro cuerpo, incluyendo la producción de enzimas digestivas y la regulación de los niveles de azúcar en la sangre ^1. Aunque en la última década, muchos estudios han contribuido a una base sólida para la comprensión de la organogénesis pancreática, persisten importantes lagunas en nuestro conocimiento de la formación de páncreas temprano ^2. Una comprensión completa de estos eventos tempranos proporcionará información sobre el desarrollo de este órgano, sino también en enfermedades incurables que se dirigen el páncreas, tales como la diabetes o el cáncer de páncreas. Finalmente, esta información se generará un modelo para el desarrollo de terapias de reemplazo de células en el contexto de la diabetes.

Durante la embriogénesis, el páncreas se origina en distintas derivaciones embrionarias endodermo del intestino anterior dorsal y ventral en el día embrionario (E) 9,5 en el embrión de ratón ^3,4. Ambos crecimientos evaginar en el mesénquima circundante como sólido epiteliosyemas L, que se someten a la proliferación, diferenciación y de ramificación para generar un órgano completamente maduro ^2,5,6. Evidencias recientes han sugerido que el crecimiento y la diferenciación de los linajes de células pancreáticas, incluyendo los que producen insulina-β-células, depende adecuada de tejido arquitectura, remodelación epitelial y posicionamiento de células en el epitelio pancreático ramificación ^7,8. Sin embargo, como la morfogénesis de ramificación se produce y se coordina con la proliferación y diferenciación en el páncreas es en gran parte desconocida. Esto es en parte debido al hecho de que el conocimiento actual sobre estos procesos de desarrollo se ha basado casi exclusivamente en el análisis de muestras fijadas, mientras que los eventos morfogenéticos son muy dinámicas.

Aquí, se presenta un método para la disección y el ratón cultivo de brotes de páncreas embrionario ex vivo en los platos inferiores de cristal, que permiten la visualización directa del desarrollo del páncreas (Figura 1). Este cultoure sistema está idealmente diseñado para la microscopía confocal de barrido láser y, en particular, de células vivas de imágenes. Explantes pancreáticos se pueden preparar no sólo a partir de embriones de ratón de tipo salvaje, sino también a partir de cepas de ratones genéticamente modificados (transgénicos o knockout por ejemplo), lo que permite estudios en tiempo real de fenotipos mutantes. Además, este sistema de cultivo ex vivo es valiosa para estudiar los efectos de los compuestos químicos en el desarrollo de páncreas, lo que permite obtener datos cuantitativos sobre la proliferación y el crecimiento, la elongación, la ramificación, tubulogénesis y diferenciación. En conclusión, el desarrollo de un método in vivo de páncreas ex explante cultura combinada con imágenes de alta resolución proporciona una sólida plataforma para la observación de los eventos morfogenéticos y la diferenciación que se producen en el embrión de ratón en desarrollo.

Protocolo

El protocolo descrito aquí es una adaptación de la técnica originalmente descrita en Percival y Slack ⁹ y optimizado para la microscopía confocal.

1. Recubrimiento de platos de cristal cultivo de fondo

Los siguientes pasos deben realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar.

1. Explantes pancreáticos se cultivan en 35-mm placas de Petri con 20-mm de diámetro con fondo de vidrio micropocillo (por ejemplo MatTek Corporation). Use un plato con fondo de cristal por explante cultura y para toda la duración del cultivo. En el día antes de la disección y el aislamiento de las yemas de páncreas, capa de los micropocillos de fondo de cristal con fibronectina.
2. Diluir la fibronectina estéril en cultivo celular de agua de grado a un 50 mg / ml de concentración final y añadir un volumen mínimo de él (~ 150 l) en los pocillos de 20-mm de las placas de MatTek cubren toda la superficie de vidrio (Figura 1E). Coloque los platosen un refrigerador a 4 º C para la incubación durante la noche.
3. En el día de la disección, aspirar la fibronectina, enjuague la microplaca de cultivo celular con agua de grado y añadir un volumen mínimo de 150 l de BME (Medio Basal de Eagle) suplementado con Pen / Strep (1%), glutamina (1% ) y 50 ug / ml de gentamicina [Medio Disección]. Dejar los platos recubiertos en la campana de flujo laminar hasta que esté listo para la placa de los explantes.

Si no todos los platos recubiertos de fibronectina se utilizan, pueden ser almacenados durante un máximo de 1 semana a 4 ° C. No dejes secado de la vajilla, los llenan de Medio Disección y colocarlos en el refrigerador.

Además de la fibronectina, los explantes pancreáticos se han cultivado con éxito en varios sustratos, como la laminina ^{9, 10,11} matrigel o membranas microporosas ^12. Debido a sus efectos sobre la ramificación, se utiliza fibronectina ⁹ como sustrato.

2. Disección de DBud páncreas Orsal de E11.5 - E12.5 embriones de ratón

1. Programado embarazadas ratones hembra en el día embrionario (E) 11,5 o 12,5 embriones son sacrificados y se recogieron usando instrumentos de disección previamente limpiados con un 70% de etanol. Coloque el útero diseccionado en 10-cm placas que contenían PBS enfriado en hielo suplementado con 50 g / ml de gentamicina.
2. Bajo un microscopio estereoscópico con iluminación desde arriba, separada del útero en segmentos de embriones individuales utilizando pequeñas tijeras o fórceps Dumont, que separar el músculo del útero y la toma de embriones individuales, que están rodeados por la decidua. Utilizar técnicas estándar de disección de embrión de ¹³ para exponer los embriones y quitar el saco vitelino y el amnios. Posteriormente, retirar la parte superior del cuerpo del embrión (por encima del hígado) y la región de la cola. Esto permitirá que la exposición de órganos internos (Figura 1B). Transferir el cuerpo mediados de los embriones en 10-cm placas que contienen medio enfriado con hielo disección BME.
3. Ahorautilizar transiluminación sólo desde abajo para visualizar y analizar el brote pancreático dorsal bajo el microscopio estereoscópico. Suavemente, abra la mitad del cuerpo del embrión mediante una incisión lateral con fórceps. Localice el estómago y el bazo. El brote pancreático dorsal está unida lateralmente a la región posterior del estómago (Figura 1C). Utilizando pinzas Dumont, diseccionar el brote pancreático dorsal de las estructuras adyacentes, tales como el estómago y el bazo, pero dejando algo de mesénquima alrededor del epitelio (Figura 1D). Utilizando una pipeta Pasteur de vidrio, transferir la yema aislado en una placa de 35-mm de Petri que contenía medio frío disección BME suplementado con 10% suero de ternera fetal [Medio de cultivo]. Repita estos pasos hasta que todos páncreas están aislados. Si páncreas de diferentes genotipos son aislados, manténgalos separados utilizando Nunc de 4 pocillos.

3. Revestimiento y Cultura de explantes de páncreas

Final de platción de los explantes se lleva a cabo en la sala de cultivo de tejidos y / o en las proximidades de la incubadora de cultivo de tejido para reducir al mínimo el movimiento físico de las culturas.

1. En condiciones estériles en una campana de flujo laminar sustituir el medio Disección BME en los platos recubiertos de fibronectina MatTek con ~ 150 l de medio de cultivo BME pre-calentado a 37 ° C.
2. Con cuidado, transferir los explantes pancreáticos en platos recubiertos Mattek (un explante por plato) para cultivo a largo plazo utilizando una pipeta Pasteur de vidrio. Para asegurar la difusión durante el cultivo, el mesénquima que rodea los explantes pueden ser ligeramente rasgado, si es necesario, con una aguja fina.
3. Con cuidado, coloque las culturas en un cultivo de tejidos incubadora (37 ° C, 5% CO ₂₎ durante algunas horas para permitir que los explantes se adhieren a los pocillos con fondo de cristal. Una vez que están unidos, se llenan los platos MatTek ml con 1,5 ml de medio de cultivo 2 de BME precalentado a 37 ° C. El día de la disección se refiere como día 0.
4. Hombreipulation de los cultivos de explantes pancreáticos se lleva a cabo en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. El medio de cultivo BME se cambió cada dos días, a menos que los requisitos experimentales dictar diferentes momentos (por ejemplo, la incubación de los explantes con agentes químicos). Los explantes pueden cultivarse en esta condición durante 5 días hasta una semana.

4. Todo el montaje Protocolo de tinción de inmunofluorescencia para explantes de páncreas

Todas las etapas del protocolo de inmunofluorescencia (de fijación para formación de imágenes) se llevan a cabo en el mismo plato MatTek, que conduce a mejores imágenes de una placa de plástico de fondo. Después de la fijación, los cultivos de explantes pancreáticos no necesitan mantenerse en condiciones estériles.

1. Aspirar el medio BME cultura y lavar el explante de una vez con 2 ml de PBS 1X.
2. Para la fijación explante sustituir PBS con 2 ml de helado de paraformaldehído al 4% (PFA) y colocar la cápsula en hielo durante 20 min. Agitar la placa suavemente de vez entiempo, pero evita las plataformas oscilantes, ya que el explante puede separar.
3. Eliminar PFA y lavar los explantes tres veces con 2 ml de 1X PBS durante 10 min cada uno a temperatura ambiente (RT).
4. Bloquear con 2 ml de solución de bloqueo (1X PBS + 0,1% de Triton-X + 3% burro suero) durante al menos 30 min a TA.
5. Diluir el anticuerpo primario en la solución de bloqueo y añadir 150 ~ l de la dilución directamente en la microplaca de 20-mm de las placas de MatTek que cubre la superficie entera de explante para la incubación durante la noche a 4 ° C. Para reducir al mínimo los movimientos físicos, añadir el anticuerpo primario a los explantes directamente en la habitación fría (4 ° C). Para evitar la evaporación, antes de añadir el anticuerpo, colocar las placas Mattek en una cámara húmeda.
6. El día siguiente se retira la solución de anticuerpo y lavar tres veces con 2 ml de PBS 1X + 0,1% Tween-20 (PBT) durante 30 minutos cada uno a TA.
7. Diluir el anticuerpo secundario en solución de bloqueo [de acuerdo con las recomendaciones del fabricante; usamos burro Alexa Fluor tintes secundaria contracuerpos en dilución 1:750] y añadir 150 ~ l de la dilución directamente en la microplaca de 20-mm de las placas de MatTek, que cubre la superficie entera de explante, por 1-2 horas de incubación a temperatura ambiente en la oscuridad. Para la contratinción nuclear, incluyen Hoechst junto con dilución de anticuerpo secundario. Para evitar la evaporación, antes de añadir el anticuerpo, colocar las placas Mattek en una cámara húmeda.
8. Lavar tres veces con 2 ml de PBS 1X + 0,1% Tween-20 (PBT) durante 30 minutos cada uno a TA.
9. Antes del montaje, lavar una vez con 1X PBS para eliminar el Tween-20. Montar al añadir una gota de medio de montaje acuoso (con anti-fading) en el micropocillo 20-mm de las placas de MatTek. Suavemente, cubra el explante con un cubreobjetos de vidrio. Evitar burbujas de aire.
10. Los explantes en las placas de MatTek puede ser visto bajo microscopía de contraste de fase estándar o microscopia confocal, dependiendo de los objetivos del experimento. Para el análisis por microscopía confocal se utiliza un Zeiss LSM 700 ajuste invertido. Configure los láseres apropiados para fluoróforos nosotrosed. Seleccionar un objetivo que será la imagen de la zona deseada del explante de páncreas. A 10 veces de agua objetivo de inmersión es adecuado para mantener el explante entero en el campo de visión. A 40x agua o en aceite de inmersión son adecuados para concentrarse en regiones específicas del explante de páncreas con una mayor resolución. Los explantes pueden ser ópticamente seccionado y luego adquirió el Z-pilas reconstruidos en 3D, usando el software apropiado.

5. En vivo imágenes de células Protocolo de explantes de páncreas

1. Configuración de la cámara del medio ambiente: utilizar un recinto ambiental y una pequeña cámara de incubación [con la temperatura y CO ₂ control] que se encuentra en la platina del microscopio. Cultivo adecuado del páncreas embrionario requiere una temperatura estable de 37 ° C y una atmósfera controlada de CO ₂ humidificado 5%. Cámaras adecuados están disponibles de varios proveedores (Por ejemplo, Zeiss, Nikon, Olympus). Montar la caja del calentador y convertirlo en unl menos 1 hora antes de la formación de imágenes se inicia para permitir que el equipo se caliente y equilibrar contenido de CO ₂ al 5%.
2. Para imágenes de lapso de tiempo de cultivos de explantes de páncreas, se utiliza un Zeiss LSM 700 microscopio invertido. Para los láseres y la selección objetiva véase el punto 4.10.
3. Deje que el páncreas explante un buen agarre al plato con fondo de vidrio antes de iniciar la formación de imágenes en directo. [Por lo general, realizar imágenes en directo a partir del día 1].
   En una campana de flujo laminar, aspirar y sustituir el medio con medio fresco explante cultura BME a comenzar con las condiciones óptimas de nutrientes.
4. Suavemente transferir los explantes a la sala de microscopio y colocar el plato MatTek en la cámara de incubación en el portamuestras del microscopio confocal.
5. Preparar el objetivo (por ejemplo, añadir aceite o agua a medio de acuerdo con la elección del objetivo de inmersión) y se centran en la región de interés en el explante. Cierre la cámara ambiental adecuada. Para evitar la evaporación durante el tiempo de lapsoadquisición con los objetivos de inmersión en agua, en lugar de agua, se recomienda utilizar los fluidos viscosos de inmersión que están disponibles comercialmente (por ejemplo, Zeiss Immersol W).
6. Configure la intensidad del láser, Z-stack parámetros de adquisición y el intervalo de tiempo (véase también la discusión de resolución de problemas). Iniciar el experimento.
7. Después de obtención de imágenes, exportación Z pilas y todos los momentos y analizarlos con el software apropiado (por ejemplo ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens).

6. Los resultados representativos

Papilas dorsales pancreáticas (junto con el mesénquima circundante) se diseccionaron de embriones de ratón de entre E11.5 y E12.5 y se sembraron directamente en placas de cultivo con fondo de vidrio (figura 1). Los vasos sanguíneos están presentes en el mesénquima que rodea el epitelio y pueden ser visualizadas mediante inmunotinción para el marcador endotelial PECAM ¹² (datos no mostrados). Después de dos días de cultivo, los explantes de páncreas underwent crecimiento significativo y empezó a organizarse en estructuras ramificadas epiteliales, cuyos núcleos fueron positivos para el factor de transcripción pancreático, Pdx1 (Figura 2A-C). El promedio z de grosor de explantes pancreáticos en el día 3 de cultivo es 60-80 micras. La superficie y el volumen de los explantes se puede medir utilizando softwares apropiados (por ejemplo, Huygens). Morfología y análisis de inmunofluorescencia mostró que los explantes pancreáticos cultivaron usando este protocolo se recapitula en la diferenciación in vivo pancreático temprano y eventos morfogenéticos ^5,10,11,14 (Figura 2). Explantes de páncreas el día 4 de cultivo se sometió típico "punta y el tronco" segregación del epitelio ^8, mostrando CPA1 + células progenitoras en las puntas de las ramas epiteliales (Figura 2 C) y + insulina diferenciadas y las células de glucagón + organizados como grupos en el interior del tronco (Figura 2D ). Además, la pancreatitisc epitelio en los cultivos ex vivo mostraron la organización del citoesqueleto y la polaridad celular, con la localización apical de F-actina (2E Figura, en verde) y b1 integrina en las membranas basales (2E figura, en rojo).

Para estudiar pancreático ramificación en tiempo real, los explantes de embriones pancreáticos se aislaron a partir de la cepa de doble color fluorescente reportero ratón membrane-Tomato/membrane-Green ¹⁵ (mT / mg; cepa de ratón está disponible en el Laboratorio Jackson) (Figura 3). Aún cuadros de un vídeo de lapso de tiempo de explantes pancreáticos mT / mg crecidas en cultivo se muestra en la Figura 3. La localización de la proteína fluorescente mT a estructuras de membrana describe la morfología celular y permite la resolución de finos procesos celulares, lo que permite realizar un seguimiento de remodelación celular y la migración con el tiempo.

Después de un 12-hora de lapso de tiempo experimento la señal de fluorescencia mT sigue siendo viable y deteCTable, aunque su intensidad se reduce, muy probablemente debido a fotodaño (Figura 3). Soluciones técnicas para evitar o reducir el daño solar y fototoxicidad se discuten en la sección de debate.

Figura 1. Representación esquemática de la disección páncreas brote dorsal de embrión de ratón E12.5. (A) Imagen de campo claro embrión de ratón E12.5. La parte superior del cuerpo del embrión (por encima del hígado) y la región de la cola se eliminan para aislar la parte media del cuerpo (B). Las incisiones se muestra por líneas rojas punteadas. (C) Resultados de la disección adicionales en la exposición del estómago y del duodeno región (indicada por la casilla punteada). El brote pancreático dorsal (véase el círculo punteado rojo) está en la base del estómago y al lado del primordio bazo. El brote pancreático dorsal disecados (D) se transfiere con una pipeta Pasteur en el pocillo de una placa inferior de vidrio que contiene medio de cultivo BME (E, F). Abreviaturas: STO (estómago), sp (bazo), dp (brote pancreático dorsal), dúo (duodeno). Barras de escala, 1000 m (A, C).

Figura 2. Todo el montaje análisis de inmunofluorescencia confocal de cultivos de explantes de páncreas. (A) campo luminoso imágenes de explantes de páncreas el día 1 y el día 2 de cultivo ex vivo. Línea roja punteada indica el inicio de la ramificación del epitelio. (B) la reconstrucción en 3D de todo el montaje inmunoticción para Pdx1 en la cultura de páncreas día 3. Explantes de páncreas mostró túbulos de Pdx1 + células se someten a extensas ramificaciones por 48 horas de las culturas. (C) Todo el montaje inmunotinción de explante de páncreas 3 días con anticuerpos contra el marcador de membrana basolateral E-cadherina (ECAD), marcador progenitor punta, carboxipeptidasa 1 (CPA1) y fosfo-histona H3 (phh3). La mayor parte de la mitosis activa phh3 + células colocalize en las puntas periféricas con CPA1 + células. L puntosines indicar la punta de las ramas. (D) Todo el montaje inmunotinción para marcadores de linaje endocrinas, insulina (Ins) y glucagón (Gluca) en el día 3. Las flechas amarillas indican las agrupaciones de Ins + y células Gluca +. Inserción (D '), de mayor magnificación de una de la agrupación de células endocrinas. (E) Todo el montaje inmunoticción de explantes de páncreas día 3 de Pdx1, β1 integrina (β1int) y F-actina (Hecho). Las células mesenquimales (asteriscos) intercalados entre Pdx1-positivas las células epiteliales. Las imágenes mostradas en C, D y E son simples secciones confocales ópticas de la serie Z. Barras de escala, 100 micras (A, B); 50 micras (CE).

Figura 3. Representante en directo imágenes de células de páncreas explante ex vivo culta. (AD), imágenes de un vídeo time-lapse de un explante de páncreas de un embrión mT / mG ratón transgénico. Tiempo de formación de imágenes se muestra en horas: minutos. El explante se formó una imagen a partir de día 1. Z-Stack imágenesse adquirieron con un objetivo de inmersión en aceite 40X cada 12 minutos por un total de 15 h. Las líneas discontinuas indican la punta de las ramas y las fronteras entre el epitelio y el mesénquima. Barra de escala, a 50 m.

Discusión

Una vez que el destino de páncreas se especifica, las células progenitoras de páncreas experimentan una proliferación extensa, la diferenciación y la morfogénesis para formar finalmente un órgano funcional madura y ^2,4. En la actualidad, la forma de ramificación tiene lugar en el páncreas y cómo está conectado a la proliferación y diferenciación de progenitor es en gran parte desconocida. Cultivos de explantes pancreáticos representan un sistema ideal para aclarar estos procesos ex vivo ^5,9,11.<...

Materiales

Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anticuerpos: La carboxipeptidasa E-cadherina F-actina El glucagón Insulina β1-integrina Pdx1 Pdx1 Fosfato histona H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes ImmunoStar Millipore Millipore Abcam Banco hibridoma Señalización Celular	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Se mantuvo en condiciones estériles
Cultivo de células agua de calidad	PAA	S15-012	Se mantuvo en condiciones estériles
Las placas de cultivo (con fondo de cristal), de 35 mm	MatTek Corporación	P35G-0-20-C
Burro Suero	Chemicon	S30-100 ml
Suero de ternero fetal Oro	PAA	A15-151	Se mantuvo en condiciones estériles
La fibronectina	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg / ml en agua de grado de cultivo celular
Gentamicina	Invitrogen	15750-037	Se mantuvo en condiciones estériles
Glutamina	Invitrogen	25030-024	Se mantuvo en condiciones estériles
4-así multiplacas	Nunc	176740
Microscopios: Microscopio Confocal invertido (LSM 700) Estereomicroscopio (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objetivos: C-Apochromat 10x / 0,45 W M27 (trabajo. dist 1,8 mm;. Profundidad de imagen ~ 100 mm); C-Apochromat 40x / 1,2 W Corr. M27 (trabajo. dist 0,28 mm;. ~ Profundidad de imagen 50 micras) La transiluminación de abajo y la iluminación de fibra óptica desde arriba
Paraformaldehído	Roth	0335.3	De la solución al 20%
Pasteur Pipeta (Glass), 150 mm	VWR	HECH567 / 1
Penicilina / Estreptomicina	PAA	P11-010	Se mantuvo en estéril condiciones
Placas de Petri de 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Placas de Petri, 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH 7,4	PAA	H15-002	Se mantuvo en condiciones estériles
Spring Tijeras 8 mm cuchilla curvada	Herramientas Artes Ciencias	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Relojería foreceps Dumont # 5	Roth	K342.1