Fusión mitocondrial se midió mediante el seguimiento de la equilibración de photoconverted matriz orientada GFP través de la red mitocondrial en el tiempo. Hasta ahora, sólo una célula podría ser sometido a un análisis cinético hora larga a la vez. Se presenta un método que mide simultáneamente varias celdas, y acelera así el proceso de recopilación de datos.
Artículo de método
Una más rápida, de alta resolución, APMt-GFP-ensayo basado en la fusión mitocondrial Adquisición de datos cinéticos de varias celdas en paralelo mediante microscopía confocal
En este artículo
Resumen
Resumen
La fusión mitocondrial desempeña un papel esencial en la homeostasis del calcio mitocondrial, la bioenergética, la autofagia y el control de calidad. La fusión se cuantifica en células vivas mediante la fotoconversión de GFP fotoactivable dirigido a la matriz (mtPAGFP) en un subconjunto de mitocondrias. La velocidad con la que las moléculas fotoconvertidas se equilibran en toda la población mitocondrial se utiliza como medida de la actividad de fusión. Hasta ahora, las mediciones se realizaron mediante un enfoque de lapso de tiempo en una sola célula, cuantificando el equilibrio en una célula durante una hora. Aquí, ampliamos y automatizamos un método previamente publicado en células vivas basado en el uso de mtPAGFP y una baja concentración de TMRE (15 nm). Este método implica la fotoactivación de una pequeña porción de la red mitocondrial, la adquisición de series altamente resueltas de secciones confocales cada 15 minutos durante 1 hora, y la cuantificación del cambio en la intensidad de señal. Dependiendo de varios factores, como la facilidad para encontrar células que expresan PAGFP y la señal de las regiones fotoactivadas, es posible recolectar alrededor de 10 células dentro de los intervalos de 15 minutos. Esto proporciona una mejora significativa en la eficiencia temporal de este ensayo, manteniendo al mismo tiempo la cuantificación subcelular altamente resuelta así como los parámetros cinéticos necesarios para capturar el detalle del comportamiento mitocondrial en su entorno citoplasmático nativo.
La dinámica mitocondrial desempeña un papel en muchos procesos celulares, incluyendo la respiración, la regulación del calcio y la apoptosis1,2,3,13. La estructura de la red mitocondrial afecta la función de las mitocondrias y la forma en que interactúan con el resto de la célula. Sometidas a una división y fusión constantes, las redes mitocondriales adoptan diversas formas, que van desde redes altamente fusionadas hasta estados más fragmentados. Curiosamente, se ha encontrado una correlación entre la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo 2A y la atrofia óptica dominante con una morfología mitocondrial alterada, específicamente redes fragmentadas4,10,13. A menudo, tras la fragmentación, las mitocondrias se desestabilizan en su potencial de membrana, y su acumulación conduce a una función celular deficiente18. Se ha demostrado que la fisión mitocondrial envía señales a la célula para avanzar hacia la apoptosis. También puede proporcionar un mecanismo mediante el cual separar mitocondrias desestabilizadas e inactivas, manteniendo así la mayor parte de la red funcional14. Por otro lado, la fusión mitocondrial permite el intercambio de proteínas de la matriz, solutos, ADN mitocondrial y el gradiente electroquímico, y parece prevenir además la progresión hacia la apoptosis9. Es necesario comprender mejor cómo la fisión y fusión mitocondriales afectan la homeostasis celular y, en última instancia, el funcionamiento del organismo, por lo que resulta imprescindible el desarrollo continuo y la optimización de los métodos para obtener información sobre estos fenómenos.
Los ensayos existentes de fusión mitocondrial han revelado diversas perspectivas sobre la fisiología mitocondrial, cada uno con sus propias ventajas. El ensayo de fusión por PEG híbrido7 mezcla dos poblaciones de células marcadas de forma diferente (mtRFP y mtYFP) y analiza la cantidad de mezcla y colocalización de fluoróforos en células fusionadas y multinucleadas. Aunque este método ha proporcionado información valiosa, no todos los tipos celulares pueden fusionarse, y las condiciones que inducen la fusión implican el uso de fármacos tóxicos que probablemente afectan el proceso normal de fusión. Más recientemente, se ha desarrollado una técnica libre de células, que utiliza mitocondrias aisladas para observar eventos de fusión basándose en un ensayo de luciferasa1,5. Dos líneas celulares humanas son modificadas para expresar ya sea la parte amino o carboxi terminal de la luciferasa de Renilla, junto con un cierre de leucina para asegurar la dimerización tras la mezcla. Se aíslan mitocondrias de cada línea celular y se fusionan. La reacción de fusión puede ocurrir sin citosol bajo condiciones fisiológicas en presencia de energía, temperatura adecuada y potencial de membrana mitocondrial interna. Curiosamente, se ha encontrado que el citosol modula el grado de fusión, demostrando que la señalización celular regula este proceso4,5. Este ensayo será muy útil para cribados de alto rendimiento destinados a identificar componentes del mecanismo de fusión, así como compuestos farmacológicos que puedan afectar la dinámica mitocondrial. Sin embargo, serán necesarios ensayos mitocondriales más detallados en células completas para complementar este ensayo in vitro y observar estos eventos en un entorno celular.
Una técnica para monitorear la dinámica mitocondrial en células completas ha estado en uso durante algún tiempo y se basa en una GFP fotoactivable dirigida a mitocondrias (mtPAGFP)6,11. Tras la expresión de la mtPAGFP, se fotoactiva una pequeña porción de la red mitocondrial (10-20 %), y se registra cada 15 minutos durante 1 hora la propagación de la señal al resto de la red mitocondrial mediante imágenes confocales con lapso de tiempo. Cada evento de fusión provoca una dilución de la intensidad de la señal, lo que permite cuantificar la tasa de fusión. Aunque la fusión y la fisión ocurren continuamente en las células, esta técnica solo monitorea la fusión, ya que la fisión no provoca una dilución de la señal de PAGFP6. La doble marcación con niveles bajos de TMRE (7-15 nM en células INS1) permite cuantificar el potencial de membrana de las mitocondrias. Cuando las mitocondrias se hiperpolarizan, incorporan más TMRE, y cuando se despolarizan, pierden el colorante TMRE. Las mitocondrias que se despolarizan ya no poseen un potencial de membrana suficiente y tienden a no fusionarse eficientemente, o no lo hacen en absoluto. Por lo tanto, las mitocondrias activas en fusión pueden rastrearse con estos niveles bajos de TMRE9,15. La acumulación de mitocondrias despolarizadas que carecen de señal de TMRE puede ser un indicio de fototoxicidad o muerte celular. Concentraciones más altas de TMRE hacen que las mitocondrias sean muy sensibles a la luz láser, por lo que debe tenerse mucho cuidado para evitar una marcación excesiva con TMRE. Si el efecto de la despolarización mitocondrial es el tema de interés, puede emplearse una técnica que utilice niveles ligeramente más altos de TMRE y luz láser más intensa para despolarizar las mitocondrias de manera controlada (Mitra y Lippincott-Schwartz, 2010). Para asegurarse de que la toxicidad debida al TMRE no sea un problema, sugerimos exponer las células cargadas (3-15 nM de TMRE) a los parámetros de imagen que se utilizarán en el ensayo (quizás 7 series de 6 secciones ópticas consecutivas) y evaluar la salud celular después de 2 horas. Si las mitocondrias aparecen demasiado fragmentadas y las células están muriendo, podrían utilizarse otros marcadores mitocondriales, como dsRED o Mitotracker red, en lugar de TMRE.
El método mtPAGFP ha revelado detalles sobre el comportamiento de la red mitocondrial que no podían visualizarse mediante otros métodos. Por ejemplo, ahora sabemos que la fusión mitocondrial puede ser completa o transitoria, en cuyo caso el contenido de la matriz puede mezclarse sin que cambie la morfología general de la red. Además, sabemos que la probabilidad de fusión es independiente de la duración del contacto y de las dimensiones del orgánulo, y que está influenciada por la motilidad del orgánulo, el potencial de membrana y la historia de actividad de fusión previa8,15,16,17.
En este manuscrito, describimos una metodología para escalar el protocolo previamente publicado utilizando mtPAGFP y TMRE 15 nM8 con el fin de examinar múltiples células simultáneamente y mejorar la eficiencia temporal de la recolección de datos sin sacrificar la resolución subcelular. Esto ha sido posible gracias al uso de una platina de microscopio automatizada y un software programable de adquisición de imágenes. El software Zen de Zeiss permite al usuario marcar y rastrear varias células designadas que expresan mtPAGFP. Cada una de estas células puede ser fotoactivada en una región específica de interés, y se pueden monitorear series de cortes confocales en busca de la señal de mtPAGFP, así como de TMRE, a intervalos determinados. Otros sistemas confocales podrían utilizarse para llevar a cabo este protocolo, siempre que dispongan de una platina automatizada y programable, y de un incubador con CO2y un medio para fotoactivar el PAGFP; ya sea un láser de múltiples fotones o un láser de diodo de 405 nm.
Protocolo
1. Imagen de preparación de la placa
- Cultura INS1 células en RPMI medios que contienen 10% de suero fetal bovino estándar, 1% de penicilina-estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, 50 mM 2-mercaptoetanol, 5 mM NaHCO 3, 2 mM de HEPES, 2 mM de ácido pirúvico, y 11 mM de glucosa a 80% de confluencia.
- Trypsinize los cultivos celulares INS1 con 0,05% de tripsina y la placa de ellos en poli-D-lisina placas recubiertas de imagen de fondo (cubreobjetos% de confluencia 30-40).
- Permita que las placas para llegar a 60-80% de confluencia (~ 2 días) y añadir matriz mitocondrial específica (COXVIII) adenoviral PA-GFP durante 24 horas (MOI = 5). Cambio de los medios de comunicación y permiten a las células a crecer durante otros 2 días antes de la imagen.
- En el día de formación de imágenes, añadir 7-15 TMRE nM a las placas de imagen, y equilibrar durante al menos 45 minutos.
- Durante este tiempo su vez en la incubadora (fase superior incubadora se ha utilizado aquí) y permitir que el microscopio se equilibre a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora. Encienda el 5% de CO 2.
2. Los parámetros de imagen para el Zeiss LSM 710 Microscopio Confocal
- Después de que el microscopio tiene equilibrada, en la pestaña de adquisición, haga clic en "Mostrar herramientas manuales", abra la imagen creada del panel, y seleccione "modo de canal" y cambiar el seguimiento de cada "cuadro".
- En el panel de trayectoria de la luz, elija LSM y el modo de canal. Trabajo desde el icono de la muestra hacia arriba, seleccione "Trasero", MBS 690 +, y MBS 488. En la parte inferior del panel, elige "T-PMT" para permitir la visualización del campo brillante o canal DIC.
- Terminar de ajustar los parámetros de ruta de acceso de luz mediante el establecimiento de la gama para el tinte de las buenas prácticas agrarias de 490-540 nm y 580-700 nm para el tinte TMRE.
- En el modo de adquisición, el uso de 512 × 512 píxeles de exploración de campo, 4x promedio, y elegir un factor de zoom (que usted puede desear para mantener constante para fines de calibración).
3. Optimización de los parámetros de imagen
- Uso de la apocromático plan de 100x (1,4 NA) lente del objetivo, focnosotros en las células con la luz halógena no, la luz fluorescente, para proteger a la mitocondria de fototoxicidad.
- Pantalla para PA-GFP células que expresan con un agujero lo más abierto y escaneo para encontrar las células que son más brillantes de color verde.
- Buscar la menor potencia del láser de 2 fotones necesarios para activar el PA-GFP y optimizar los parámetros de imagen para garantizar que la señal no saturar el detector. Compruebe que la señal PA-GFP colocalizes con la señal de TMRE para unos pocos z-series. La pérdida de la señal TMRE indica despolarización mitocondrial o fototoxicidad, y las células exhibiendo estas características no debe ser utilizado para el análisis.
- Buscar una celda PA-GFP expresar y especificar un factor de zoom.
- Ajuste el rango de la serie Z para recoger 6 rebanadas (de este rango se necesitan para satisfacer todas las 10 celdas a menos que específica-z de enfoque se fija en cada posición).
- Guarde el método de imagen para cada celda (la celda 1, celda 2, etc.)
4. Ajuste el AutomatizarParte D del programa y designar a las 10 celdas que usted seguirá para el ensayo de fusión mitocondrial 1 Hora
- En el panel izquierdo de la ventana MultiTime, seleccione la opción "ahorro" del panel, y especifique la ubicación donde los archivos se guardarán.
- En la "Adquisición" del panel, cargar el método de adquisición salvo para la celda 1 en la configuración de escaneo y marca la casilla de pila z. Además, puede seleccionar "marca Z-media de la pila de z".
- En el "bloques" del panel, seleccione "solo bloque en cada lugar". Haga clic en "bloques" add para cada intervalo que debe medirse.
- En el "timing" del panel, seleccione "Intervalo de espera" y tipo "0" en el "intervalo de espera antes de bloque en la ubicación de sólo la primera". Bloques 2-4 tendrá "15 minutos" en esta sección.
- En el panel de ubicación, seleccione "mover el foco al cargar la posición entre los lugares" y "analizar la carga de configuración cuando se 'mueven a la loc' o hacer clic en 'siguiente loc'. En virtud de la" lista de lugares de edición ", seleccione" borrar todo "y luego seleccione" múltiples lugares motorizada etapa ".
- Under el "blanqueo" del panel, haga clic en el "blanqueo" y, a designar el archivo de configuración en la "configuración" del menú desplegable, según lo señalado en la ventana del programa principal. Luego, en el "blanqueamiento" de la ventana, sino el método de fotoactivación apropiado. En el panel de las regiones, elija el retorno de la inversión para esta célula en particular, y añadir este retorno de la inversión a la MultiTime por la elección "región actual añadir a la lista retorno de la inversión" de la ventana. Asegúrese de seleccionar el mismo lugar en el "retorno de la inversión" en el menú desplegable.
Por el momento para que funcione correctamente y para que cada célula tiene un intervalo de 15 minutos, dos métodos necesitan ser salvados. En la lista de bloques, el primero tendrá la "real" de configuración de fotoactivación, y el resto tendrá un "simulacro" de configuración que no utiliza el láser de dos fotones. El primer bloque también será el único bloque que no tiene un retardo (BKIntv = 0). Por lo tanto, el método comienza con una exploración inicial, seguido por una exploración de fotoactivación. El resto de los bloques tienen un 900 seg BkIntv, yen cada momento hay dos exploraciones como en el tiempo 0 segundos, para mantener la consistencia de tiempo.
- Para cada una de las 10 celdas que deben seguirse a través del tiempo, lleve a cabo la siguiente secuencia:
Encuentre un PAGFP célula que expresa-salvar su método de imagen
Ubicación panel marcar la posición del portaobjetos, especificar el método de imagen
Retorno de la inversión principal panel elija una región de interés para Bleach fotoactivado del panel de ahorro de retorno de la inversión específica y también carga en la caja de retorno de la inversión:
Borrar el retorno de la inversión y restablecer el zoom de exploración a 1
Encuentra la celda de al lado y establecer el zoom
Repita el proceso para los próximos 9 celdas
Compruebe que cada lugar el escenario y todos los bloques tienen el método de imagen apropiado (la configuración de análisis) asociados. También asegúrese de que el primer bloque en cada ubicación se corresponde con el método de fotoactivación adecuada, mientras que el resto contiene un "simulacro" método. Finalmente, seleccione "Ejecutar".
5. Analizar la intensidad de señal PA-GFP
- para las células en las que la señal de las buenas prácticas agrarias-fotoactivable colocalizes con la señal de TMRE rojo, restar el fondo en las imágenes PAGFP (aquí usamos MetaMorph).
- A continuación, exportar los datos a Excel y calcular la intensidad media de z-pilas en cada momento. Eliminar secciones ópticas que no tienen señal.
- Medir la dilución de la señal en cada z pila mediante el cálculo del porcentaje de la señal fotoactivada original.
Cada punto de datos se escanea y se registró el doble, lo que resulta en duplicado z pila información para cada punto de tiempo. Compruebe que los valores de Z-Stack están de acuerdo. Si no, lo que es indicativo de un problema (atención por ejemplo, el movimiento celular).
6. Los resultados representativos
Cuando una actividad de fusión se produce entre un activado y no activado-PA-GFP mitocondria, la PAGFP dentro de la matriz mitocondrial se mezcla con la matriz no marcada y se diluye en un área mayor, disminuyendo la señalintensidad (Figura 1A). En la celda INS1, una disminución significativa en la intensidad de la señal se produce cada 15 minutos, hasta que el equilibrio de fusión mitocondrial ha sido alcanzado (aproximadamente 1 hora). Tenga en cuenta que la celda en la Figura 1B muestra colocalización casi completa de la PA-GFP y señales TMRE. En estos ensayos una concentración muy baja de TMRE (15 nM) se utiliza para ayudar a orientar la fotoactivación de PAGFP, y también para controlar la salud celular. Las células con una gran cantidad de mitocondrias despolariza tendrá colocalización incompleta de PAGFP y TMRE y no debe ser analizada, porque esto indica fototoxicidad o células en un estado moribundo.
El tiempo de equilibrio para la fusión mitocondrial es usualmente de 1 hora en INS1 células, cuando ~ 15% del volumen mitocondrial se activa. A veces, incluso si un área pequeña es iluminada, la mayoría de las mitocondrias se fotoactivados debido a ser altamente red, en cuyo caso la fusión adicional es difícil de detectar. Otros tipos de células pueden mostrar diferentes momentos de equilibrio y deben ser examinados a intervalos más cortos y más de un período más largo para caracterizar la dinámica de la mitocondria. Para inhibir la fusión mitocondrial, las células se pueden colocar dentro de un entorno lipotóxico. Previamente se ha demostrado que 0,4 mM palmitato fragmentos mitocondrias, e inhibe la fusión mitocondrial 9. Este efecto puede verse en la Figura 2, donde las mitocondrias están fragmentados, pero la intensidad de la señal de la mtPAGFP no cambia tanto como en condiciones normales (Figura 1). Por lo tanto, la dilución de la señal de PA-GFP es probable que sea debido a la fusión mitocondrial en lugar de fisión. En otros tipos de células, le sugerimos que utilice otras formas conocidas para inducir la fragmentación mitocondrial, como silenciar OPA1 que es necesario para la fusión mitocondrial 14.
Figura 1. dilución Típica de la señal de PA-GFP después de la fotoactivación durante un ensayo de fusión mitocondrial. A. PA-GFP se vuelve progresivamente más tenue debido a eventos de fusión mitocondriales que conducen a la dilución de la proteína sobre un área creciente como puede verse en estas imágenes proyectadas de 6 secciones ópticas cuantificó cada 15 minutos. B. TMRE con PA-GFP muestra que las mitocondrias son activos y no despolariza. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. La fusión mitocondrial inhibido con palmitato 0,4 mM disminuye la dilución del PA-GFP. A. Proyecciones de 6 secciones ópticas que muestran las mitocondrias corto con una intensidad de la señal cambia con el tiempo. Colocalización B. PA-GFP con TMRE muestra que las mitocondrias no son depolarizado. Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Discusión
Este método permite la formación de imágenes de alrededor de 10 células a la vez, si la adquisición se produce cada 15 minutos después de la fotoactivación. El número exacto de células dependerá de lo rápido que uno es capaz de localizar y marcar las células que expresan mtPAGFP dentro de la placa de cultivo, y la rapidez con que se puede configurar todos los parámetros del software. Para realizar la automatización sin problemas una capa uniforme de las células deben ser utilizados porque los designados z-stack márgenes se aplicará para todas las células.
El tamaño de esta zona fotoactivación inicial regirá el tiempo de equilibrado. Para ser capaz de medir la fusión mitocondrial, es importante para fotoactivar sólo 10-20% de la red, de tal manera que la propagación de la señal al resto de la red se puede controlar con el tiempo. Si es demasiado buena parte de la red se fotoactivados, es posible que la fusión completa se producen con demasiada rapidez, y el evento no será capturado.
El cuidado extremo se debe tomar paraajustar la potencia del láser del láser de dos fotones, así como la concentración TMRE para evitar fototoxicidad que conduce a la despolarización mitocondrial. Asegurarse de que la señal de mtPAGFP colocalizes con la señal de TMRE puede ayudar en la evaluación de fototoxicidad y la salud general de las células 8,15. La iluminación con luz epifluoerescent debe ser evitado. Si bien la búsqueda de células que expresan mtPAGFP, el agujero debe ser lo más abierto durante la exploración con una excitación de 488 nm de bajo poder. Ajuste de la potencia del láser de dos fotones para fotoactivar suficiente PA-GFP para medir la señal durante 1 hora, pero no a sobresaturar cualquiera de las celdas puede ser complicado 8. Sin embargo, el tiempo debe ser gastado en esta etapa debido a la optimización de programa automático se inicia, es tedioso para detenerlo, para elegir más células, y curriculum vitae.
Para el control de la calidad, la adquisición de un contraste de interferencia diferencial (DIC) de la imagen (o de luz transmitida) para controlar el foco en las células puede ser muyútil y también una buena manera de detectar las burbujas formadas en el aceite de inmersión durante la exploración, lo que ocurre a veces de los movimientos de la etapa.
Aunque el uso de este método mtPAGFP recoge datos sobre el movimiento unidireccional de proteínas de la matriz mitocondrial de las mitocondrias fotoactivados a los que no están etiquetados, es posible utilizar esta técnica para estudiar otros procesos. Por ejemplo, fluorocromos específicos se puede unir a las proteínas de membrana para observar su movimiento específico durante los eventos de fusión, como se ha demostrado para ABC-me, la fusión de la que se produce en una escala de tiempo diferente de la mezcla de proteínas de la matriz solubles 15.
Divulgaciones
La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Zeiss, Inc.
Agradecimientos
Damos las gracias al Centro Tufts para Investigación de Neurociencia, P30 NS047243 (Jackson), la afinidad de las mitocondrias de Investigación Cooperativa (mtARC) apoyado por el Centro para la Investigación Biomédica Evans Interdisciplinario de la Universidad de Boston Medical Campus, Link Corporation Medicina, y Zeiss para apoyar este trabajo.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| COXIII-adenoviral PA-GFP | Lippincott-Schwartz Dr. | ||
| TMRE | Invitrogen | T669 | |
| Zeiss LSM 710 confocal | Zeiss |
Referencias
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