Establecimiento de cultivos de enriquecimiento microbianos eucariotas a partir de un estratificado químicamente lago de la Antártida y evaluación del potencial de carbono de fijación

Resumen

Eucariotas microbianos son tanto una fuente de carbono derivado de la fotosíntesis y las principales especies depredadoras en forma permanente lagos cubiertos de hielo del Antártico. Este informe describe un enfoque de enriquecimiento de la cultura para aislar microbios eucariotas metabólicamente versátiles desde el lago de la Antártida, el lago Bonney, y evalúa el potencial de fijación de carbono inorgánico utilizando un ensayo de radioisótopos para la ribulosa-1 ,5-bisphophate carboxilasa oxigenasa (Rubisco) la actividad.

Resumen

Lago Bonney es uno de los numerosos permanentemente cubiertas de hielo lagos situados en los valles secos de McMurdo en la Antártida. La capa de hielo perenne, mantiene una columna de agua estratificada y químicamente a diferencia de otros cuerpos interiores de agua, impide en gran medida la entrada externa de carbono y los nutrientes de los ríos. Biota están expuestos a múltiples presiones ambientales, incluyendo el año severa deficiencia de nutrientes, las bajas temperaturas, sombra extrema, hipersalinidad, y la oscuridad de 24 horas durante el invierno ^1. Estas condiciones ambientales extremas limitar la biota del lago Bonney casi exclusivamente a los microorganismos ^2.

Unicelulares eucariotas microbianos (llamados protistas ") son actores importantes en el ciclo biogeoquímico global de ³ y desempeñan importantes funciones ecológicas en el ciclo del carbono en los lagos secos de los valles, ocupando ambos roles primario y terciario en la cadena alimentaria acuática. En los valles secos de alimentos acuáticos web, los protistas que fijannorganic de carbono (autotrofia) son los principales productores de carbono orgánico para los organismos organotrófico ^{4, 2.} Phagotrophic o protistas heterótrofos capaces de ingerir bacterias y protistas más pequeños actúan como los principales depredadores en la cadena alimenticia ^5. Por último, una proporción desconocida de la población protista es capaz de metabolismo combinado mixotrófica ^{6, 7.} Mixotrofía de protistas implica la capacidad de combinar la capacidad fotosintética con la ingestión de los microorganismos phagotrophic presa. Esta forma de mixotrofía difiere de metabolismo mixotrófico en especies bacterianas, que generalmente implica moléculas de absorción de carbono disuelto. En este momento hay muy pocos aislamientos protistas de forma permanente cubierta de hielo polares, lagos, y los estudios de la diversidad de los protistas y la ecología en este entorno extremo ha sido limitada de ^{8, 4, 9, 10, 5.} Una mejor comprensión de la versatilidad metabólica protista en la web simple alimento seco valle del lago ayudará en el desarrollo de modelos para la role de los protistas en el ciclo global del carbono.

Se empleó un enfoque de enriquecimiento de la cultura para aislar a los protistas potencialmente fototróficas y mixotrófica del lago Bonney. Profundidades de muestreo en la columna de agua fueron elegidos en base a la ubicación de la producción primaria máximos y protista diversidad filogenética ^{4, 11,} así como la variabilidad en los principales factores abióticos que afectan los modos de protistas tróficos: poca profundidad de muestreo están limitados por los nutrientes importantes, mientras que a mayores profundidades de muestreo están limitados por la disponibilidad de luz. Además, las muestras de agua del lago se complementaron con múltiples tipos de medios de crecimiento para promover el crecimiento de una variedad de organismos fototróficas.

RubisCO cataliza el paso limitante en la Bassham Calvin Benson (CBB) del ciclo, la principal vía por la cual organismos autótrofos fijar el carbono inorgánico y carbono orgánico para proporcionar los niveles tróficos más altos en las cadenas alimentarias acuáticas y terrestres ^12. En este estudio, we aplica un ensayo de radioisótopos modificado para ¹³ muestras filtradas para controlar la actividad carboxilasa máxima como una aproximación a la potencial fijación de carbono y la versatilidad metabólica en los cultivos de enriquecimiento del lago Bonney.

Protocolo

1. Ejemplo de Adquisición

1. Elija y prepare el sitio de muestreo un día antes de muestreo de la columna de agua. Esto permitirá que las capas estratificadas de la columna de agua a la reforma después de una perturbación debido a la perforación y la fusión del hielo-agujero. Identificar la ubicación del sitio de perforación con el GPS.
2. Para acceder a la columna de agua, comience por la perforación de un agujero en el hielo con un taladro del hielo Jiffy conectado a una extensión de Jiffy de 4 pulgadas de vuelo y un poco de corte. Para evitar la congelación de la broca en el agujero, trate de evitar la perforación en el agua en estado líquido mediante la detención de perforación de aproximadamente 4-6 cm por encima de la parte superior de la columna de agua.
3. El taladro tendrá que ser ampliado de un diámetro de 15 a 60 cm antes del muestreo. Esto se logra mediante el uso de un horno de fusión agujero (Modelo Hotsy) que circula glicol polietileno caliente a través de un tubo de cobre. Agujero de fusión suele durar hasta 18 horas.
4. Antes de que el muestreo de la columna de agua, asegúrese de que todo el equipo necesario y la muestra de Sanvasos orage se ensamblan en el sitio de muestreo. Materiales de muestreo incluyen: botella de Niskin (L de capacidad 5-10), cabrestante con la profundidad calibrada por cable, Messenger, botellas suficientes muestras para cada profundidad de muestreo y refrigeradores para el transporte de muestras.
5. Comenzar el muestreo temprano en el día (~ 5 horas), como el filtrado de agua de los lagos debe ser completado en el día del muestreo. Recoger muestras de agua (1.5 L) de las profundidades deseadas (para este estudio: 6-m, 15 m, y de 18 m profundidad de muestreo, medidos desde el nivel del agua piezométrico en el agujero de hielo) con un sampler Niskin conectado a un calibrado la mano del cabrestante. Para evitar la perturbación de la columna de agua antes de recolectar poca profundidad más profundos.
6. Tienda lago muestras en cámaras frigoríficas y transporte desde el sitio de la muestra al laboratorio de campo con un trineo conectado a un ATV (vehículo todo terreno). Las muestras deben ser tratados o estabilizados (por ejemplo: congelación de flash en nitrógeno líquido) en el laboratorio de campo inmediatamente después de la toma de muestras.

2. Development de cultivos de enriquecimiento

1. Para el cultivo de cultivos de enriquecimiento, concentrado 0,5-1 litros de agua del lago a 47 mm de 0,45 micras de tamaño de poro de filtración con filtros de polietersulfona suave (<0,3 atm). Si la diversidad de la comunidad natural que se desea, se filtra una segunda muestra en 47 mm de 0,45 micras de tamaño de poro filtros de polietersulfona y seguir los protocolos de acuerdo a Bielewicz et al. ⁴ para eucariota diversidad filogenética.
2. Transferir filtros a 50 ml tubo estéril halcón contiene ~ 20 ml de agua del lago filtrada obtenida de la profundidad de muestreo igual a la del filtro. Lave suavemente las células del filtro utilizando una pipeta estéril.
3. Transferir suspensión celular a un 25 cm ² matraz estéril de cultivo celular. Añadir agua filtrada lago recogidos de cada profundidad de la muestra para aumentar el volumen de cultivo a 45 ml. Crear múltiples repeticiones para cada profundidad de muestreo, si enriquecimiento en diferentes medios de cultivo de los deseados.
4. Suplemento frascos de cultivo con 50X ssoluciones terile a una concentración final de 1X de los siguientes medios de cultivo: Medio Basal de Bold, BG11 y F / 2. Si el cultivo de organismos mixotróficos se requiere, configuración dos buques F/2-supplemented y añadir 2-3 granos de arroz estéril a uno de los matraces.
5. Incubar los frascos de cultivo a baja temperatura (4 ° C) y baja radiación (fotones de 20 mol m ^-2 s ^-1) en un crecimiento con control de temperatura de la incubadora al menos 4 semanas en la Antártida antes de su envío al laboratorio de EE.UU.. Si se desean aislamientos, la placa de 250 ml del cultivo de enriquecimiento en placas de agar que contienen los medios apropiados de crecimiento después de dos semanas de incubación.
6. Para el envío a los EE.UU., los cultivos de enriquecimiento de transferencia a estériles de 50 ml tubos Falcon. Requisito de solicitar el envío de "no congelar" y "mantener la calma" en el envío de solicitud. Si bien el proceso de envío de la Antártida es relativamente rápido (2 semanas por vía aérea comercial) y muy fiable, hay una posibilidad de pérdida de órgano fastidiosoismos durante el proceso de transporte. Por lo tanto, los investigadores pueden querer preservar una submuestra antes de su envío de manera que la pérdida de algunas especies durante el proceso de envío se puede evaluar.
7. A la llegada en los EE.UU., la transferencia de 5 ml de cultivo de enriquecimiento en 45 ml de medio de crecimiento apropiados en un matraz Erlenmeyer de 125-ml estéril tapado con una esponja estéril. Los cultivos de enriquecimiento debe mantenerse como culturas de pie en una temperatura de la cámara controla el crecimiento del medio ambiente (cámara de crecimiento diurno, VWR) a 4 ° C/20 mol fotones m ^-2 s ^-1. Los cultivos deben ser transferidos a medio fresco cada 30 días.

3. La extracción de la célula lisado de Enriquecimiento filtrados

1. Filtro de 5 ml de cultivo de enriquecimiento en un 25 mm Whatman GF / F con filtro de vacío suave (menos de 10 psi). El filtro se puede almacenar durante varias semanas a -80 ° C antes de analizar la actividad Rubisco.
2. Cortar el filtro en secciones de 4-5 con una tijera de acero estériles ytransferencia de las piezas con pinzas estériles a un tubo de 2 ml tapón de rosca llena de una quinta parte de la forma completa con 0,1 mm de diámetro de circonio / sílice cuentas.
3. Añadir 1,25 mL de tampón de extracción del filtro (50 bicina mM, 10 mM de MgCl _2, 1 mM EDTA, 5 mg / ml de BSA, y 0,1% de Triton X-100; añadir fresco: 10 mM NaHCO $ _3, 10 mM de DTT, 3,3 mM de aminocaproico ácido, 0,7 benzamidina mM, pH 7,8) ¹³ e interrumpir las células utilizando un batidor Minibead tres veces durante 30 s con el ajuste de velocidad 48. Para evitar un calentamiento de la muestra, beadbeating alternan con 1 incubación hielo min.
4. Centrifugar suspensión filtro durante 2 minutos a 3000 xga 4 ° C para formar un gránulo suelto de GF / F fibras de filtro y los restos de la pared celular.
5. Quitar una parte alícuota de 200 uL y se sumergen en 800 l de helado de acetona al 90%. Medir la clorofila extraíble (chl) una en un espectrofotómetro a los valores de longitud de onda de 664 nm y 647 nm ^14. Transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
6. Centrifugar remaining sobrenadante a 4 ° C durante 2 min a 15.000 xg, y transferir el sobrenadante (evitar el sedimento de las membranas celulares insolubles y restantes GF / F fibras de filtro) a un tubo de microcentrífuga limpio 1,5 ml. Este lisado celular soluble ahora se puede utilizar en el ensayo de la actividad Rubisco carboxilasa.
7. Lisado puede ser almacenada a -80 ° C después de la adición de 12,5% de glicerol y la congelación de flash en nitrógeno líquido. Una pérdida de actividad puede producirse después de múltiples de congelación / descongelación ciclos dependiendo de la sensibilidad de las enzimas en el lisado. Por lo tanto, la actividad de lisado de fresca congelada frente debe ser probado antes en gran escala de células lisado extracciones.

4. RubisCO actividad carboxilasa Ensayo filtro

1. Transferir 125 l de lisado soluble a un tubo de 15 ml tornillo microcentrífuga tapa (la tapa no es necesario) que ha sido enfriada en hielo. Para las muestras de control negativo, añadir 125 lisado soluble l a 15 ml tubo de microcentrífuga de tornillo tapa, pero no añadir sustrato (en el paso 4,7). Ejecutarduplicar las reacciones de todas las muestras y los controles negativos.
2. Preparar 10 ml de tampón de ensayo fresco (50 mM Bicine-NaOH, pH 8,0, 50 mM NaHCO _3, 25 mM de MgCl ₂₎ y enfriar en hielo. Alícuota suficiente del tampón de ensayo para todas las muestras y los controles negativos (100 l por muestra / control más 100 l adicional) a un tubo de 5 ml. Lleve a cabo todos los pasos subsiguientes en una campana extractora.
3. Añadir 40 l de NaH ¹⁴ CO ₃ (500 Ci / ml) por ml de tampón de ensayo para el buffer de alícuotas y mantener el buffer en hielo.
4. Retirar 10 l del tampón de ensayo que contenía ¹⁴ C y se diluye en 1 ml de tampón de ensayo. Después de invertir para mezclar, añadir 100 ml de la mezcla diluida 1:100 a 3 ml de Bio-Safe II centelleo contando cóctel en un vial de centelleo. Invertir para mezclar. Recuento de centelleo (Beckman LS6500) debe ser más de 18.000 copias por minuto antes de continuar con el ensayo.
5. Cuando un número suficiente de NaH ¹⁴ CO ₃ ha sido añadido a la tampón de ensayo,mover los tubos de reacción a un baño seco preajustado a 25 ° C y se incuba durante 3-5 minutos.
6. Añadir 100 l de tampón de ensayo a los lisados ​​e incubar durante 5 min a 25 ° C.
7. Añadir 20 l de 15 mM de ribulosa bisfosfato, a las muestras y permitir que la reacción proceder durante 5-10 minutos a 25 ° C.
8. Añadir 100 l de ácido propiónico (100%) (Fisher) para detener la reacción. Centrifugar durante 1 hora a 2.000 xg de agotamiento de los no incorporada ¹⁴ C.
9. Transferir el volumen total de las muestras a viales de centelleo que contenían 3 ml de Bio-Safe II cóctel de centelleo contando. Determinar cpm de productos ácidos finales estables por recuento de centelleo (B. Witte, R. comunicación Tabita personal).
10. Calcular las tasas de actividad de Rubisco en un chl una base ^14.

5. Los resultados representativos

Hemos utilizado el cultivo de enriquecimiento para aislar fototróficas adaptado al frío y protistas mixotróficos que residían en la Antártida LAke Bonney. Para capturar una mayor diversidad de organismos, hemos probado tres tipos de medios de cultivo: Medio basal de Bold (BBM) ^15, F/2-Si Medio Marino ^{16, 17} y ¹⁸ BG11 Medio. La inspección visual de los cultivos de enriquecimiento por microscopía óptica reveló que los cultivos fueron dominada por protistas fototróficas (indicado por la presencia de pigmento clorofila en la mayoría de las células) y albergaba una variedad de morfologías celulares en función de la profundidad de muestreo de la cual se tomó el inóculo y el tipo de medios utilizados en el cultivo (Fig. 1).

Se midió los niveles máximos de actividad carboxilasa catalizada por la enzima RubisCO como una aproximación a la potencial fijación de carbono. Chl a la abundancia ha sido monitorizada como una estimación de la biomasa fototróficas protistas (Fig. 2). A pesar de cultivo de todas las culturas en las mismas condiciones de temperatura / luz de régimen (es decir, 4 ° C/20 mol m ^-2 s ^-1), el potencial de fijación de carbonoy la biomasa fototróficas varió dramáticamente entre los cultivos de enriquecimiento. Máxima actividad RubisCO se observó en cultivos de enriquecimiento de cultivo, ya sea en BBM (Enriquecimientos 4 y 6) o BG11 (Enriquecimientos 13 y 14) medios de crecimiento, mientras que los cultivos enriquecidos en medio de crecimiento F / 2 (Enriquecimientos 19, 21, 23) exhibió un 4 - a 34 veces menor actividad carboxilasa máximos. Estas diferencias no se deben a los niveles más bajos de biomasa en los cultivos de F / 2, ya que la actividad carboxilasa se expresó en un Chl una base. Por otra parte, la actividad Rubisco no se correlacionó con la concentración de chl a (r = -0,023, p> 0,1;. La figura 2, recuadro). Las culturas BBM inoculados con el agua del lago de 6 my 15 m (Enriquecimientos 4 y 5) tuvo el mayor Chl a los niveles, mientras que todas las otras culturas exhiben chl relativamente bajo a, independientemente de la actividad de la enzima rubisco (Fig. 2).

Figura 1.Representante microbianos eucariotas culturas enriquecimiento que hemos seleccionado para el crecimiento de organismos diferentes. Identidad de la cultura se da en la parte inferior izquierda de los paneles. Todas las imágenes representan micrografías de luz generados usando aceite de inmersión con un aumento de 1000X.

Figura 2. La capacidad potencial de fijación de carbono y clorofila extraíble unos niveles en los cultivos de la Antártida microbianos eucariotas aislados de enriquecimiento del lago Bonney y se cultiva en diversos medios de cultivo. Ver Tabla 1 para más detalles cultura Recuadro:. De correlación de Pearson entre la clorofila un potencial de fijación de carbono en abundancia y culturas microbianas antárticas enriquecimiento eucariotas.

Discusión

Estudios moleculares recientes han reportado una gran diversidad de eucariotas unicelulares a través de una amplia gama de entornos de ^{3, 19, 20,} sin embargo, debido a la falta de aislados en toda la gama de hábitats protist el papel funcional de estas especies individuales en las redes alimentarias son en gran parte desconocido. En este estudio, se han descrito métodos para enriquecer a las especies eucariotas microbianas presentan versatilidad metabólica de un ambiente relativamente undersampled, una perman...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BBM	Sigma	B5282
BG11	Sigma	C3061
F / 2	Sigma	G9903
GF / F filtro, 25 mm	Fisher Scientific	09-874-64
GF / F filtro, 47 mm	Fisher Scientific	09-874-71
Polietersulfona filtro, 0,45 micras de poro, 47 mm	Pall Life Sciences	61854
Estéril frasco de cultivo celular, 25 cm2	Corning	430639
Diurnal cámara de crecimiento	VWR	35960-076
Zirconia / perlas de sílice, 0,1 mm diamter	BioSpec Productos	11079101z
Mini-bolas batidor	BioSpec Productos	3110BX
Con tapón de rosca del tubo de microcentrífuga (1,5 l)	EE.UU. Científico	1415-8700
NaH 14 CO 3	ViTrax	VC 194	Mantener en alícuotas de 400 l a -20 ° C
RuBP	Sigma	R0878-100mg	Disolver en 10 mM Tris-propiónico (pH 6,5)