Artículo de método

El α-test: Rapid libre de células CD4 enumeración utilizando toda la saliva

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DOI:

10.3791/3999

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16 de mayo de 2012

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1Department of Medicine, Weill Cornell Medical College , 2Department of Oral Biology, University of Missouri-Kansas City-School of Dentistry, 3Department of Pharmacology and Toxicology, University of Missouri Kansas City- School of Pharmacy, 4Regional Hospital, Bamenda, NWP, Cameroon, 5Mezam Polyclinic HIV/AIDS Treatment Center, Cameroon, 6Institute for Human Genetics and Biochemistry

En este artículo

Resumen

Un método de enumeración de CD4, la α-test, se describe que utiliza toda la saliva para proporcionar recuentos de células CD4 rápidos y precisos. Las pruebas α-cuesta centavos y elimina la necesidad de formación técnica, reactivos costosos, como los anticuerpos monoclonales, instrumentación, refrigeración, transporte de muestras, así como la recolección y el manejo de sangre.

Resumen

Hay una necesidad urgente para el recuento de CD4 asequibles para controlar la enfermedad del VIH. Recuento de CD4 está fuera del alcance de las regiones con recursos limitados, debido a la restricciones de tiempo y temperatura, la sofisticación técnica, y el costo de los reactivos, en particular los anticuerpos monoclonales para medir los CD4 en las células de la sangre, el único método aceptable. Una estrategia de uso común de ahorro de costes y ahorro de tiempo de laboratorio consiste en calcular, en lugar de medir los valores sanguíneos determinados. Por ejemplo, los niveles de LDL se calculan utilizando los niveles medidos de colesterol total, HDL y triglicéridos 1. Por lo tanto, la identificación de células libres de los correlatos que regulan directamente el número de células CD4 + T podría proporcionar un método exacto para calcular el recuento de células CD4, debido a la importancia fisiológica de las correlaciones.

El número de células madre que entran a la sangre y están destinados a convertirse en circulación células T CD4 + está determinada por la quimioquina CXCL12 unª de su receptor CXCR4, debido a su influencia sobre la locomoción 2. El proceso de la locomoción de las células madre en sangre es, además, regulada por la superficie celular elastasa de leucocitos humanos (HLE CS) y la ELH CS-reactivo activo α 1 inhibidor de proteinasa (PI 1 α, α 1 antitripsina, SERPINA1) 3. En la enfermedad de VIH-1, α 1 PI está inactiva debido a procesos de la enfermedad 4. En las categorías primeros asintomáticos de VIH-1 enfermedad, activo α 1 PI se encontró que era inferior a lo normal en el 100% de VIH-1 no tratados los pacientes (mediana = 12 mM, y para lograr niveles normales durante las categorías sintomáticas 4, 5. Este patrón se ha atribuido a la inactivación inmune, no a la síntesis insuficiente, la inactivación proteolítica, o la oxigenación. Hemos observado que en VIH-1 sujetos con CD4> 220 células / l, el recuento de CD4 se correlaciona con los niveles séricos de PI activo α 1 (R 2 = 0,93, p < 0.0001, n = 26) y los inactivos α 1 PI (R 2 = 0,91, p <0,0001, n = 26) 5. La administración de α 1 PI al VIH-1 en individuos infectados y no infectados como resultado aumentos significativos en los recuentos de CD4 que sugieren α 1 PI participa en la regulación del número de células T CD4 + en la sangre 3.

Con la estimulación, toda la saliva contiene exudado seroso suficiente (plasma que contiene material proteínico que pasa a través de las paredes de los vasos sanguíneos en la saliva) para permitir la medición de la actividad α 1 PI y la correlación de esta medida es evidencia de que es un método preciso para calcular los recuentos de CD4. En pocas palabras, sialogogos tales como la goma de mascar o ácido cítrico estimula la exudación de suero en la saliva toda la boca. Después de la estimulación exudación de suero, la actividad de suero α 1 PI en la saliva se mide por su capacidad para inhibir la actividad de la elastasa. Elastasa pancreática porcina (EPP)es una fuente barata fácilmente disponibles de la elastasa. PPE se une a α 1 PI formando un complejo uno-a-uno que evita PPE de escindir sus sustratos específicos, uno de los cuales es el péptido colorimétrico, succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA 3 NA). Incubando saliva con una concentración de saturación de PPE durante 10 min a temperatura ambiente permite la unión de PPE a toda la sesión α 1 PI en la saliva. La inhibición de PPE por activo α 1 PI puede ser medido mediante la adición del PPE sustrato SA 3 de NA. (Figura 1). Aunque los recuentos de CD4 se miden en términos de volumen de sangre (células CD4 / l), la concentración de α 1 PI en la saliva se relaciona con la concentración de suero en la saliva, no al volumen de la saliva puesto que el volumen puede variar considerablemente durante el día y persona a persona 6. Sin embargo, prácticamente toda la proteína en la saliva es debido al contenido de suero, y el contenido en proteínas de la saliva es MEAmensurable 7. Por lo tanto, activa α 1 PI en la saliva se calcula como la relación al contenido de proteínas y la saliva se denomina α 1 Índice de PI. Los resultados presentados en este documento demuestran que la α 1 Índice de PI proporciona un método fisiológico exacto y preciso para el cálculo de los recuentos de CD4.

Protocolo

1. Preparar soluciones frescas de Trabajo

  1. TBS: 0,05 M de Tris Buffered Saline pH, 7,8 (TBS). Preparar 60 ml de TBS / microplaca.
  2. EPI: elastasa pancreática porcina, de tipo 1 (EPP) se proporciona como una suspensión. Agitar bien y diluir PPE en TBS a aproximadamente 0,01 U / ml. Preparar 6 ml de solución de trabajo / microplaca).
  3. SA 3 NA: succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida (SA 3 NA). Prepare 0,1 M de valores SA 3 solución de NA en dimetilsulfóxido (DMSO) y utilizar inmediatamente o almacenar a -20 ° C. Preparar la solución de 6 ml de trabajo / microplaca mediante la dilución de valores SA 3 solución de NA 1/100 en TBS.
  4. Azul de Coomassie: Prepare una solución madre de Coomassie Brilliant Blue 10% de R-250 (Azul de Coomassie) en TBS y utilizar inmediatamente o almacenar a -20 ° C. Preparar 6 ml de solución de trabajo diluyendo la solución madre 1/1000 en TBS.

2. Preparar la saliva

  1. Colector de saliva: En la posición de pie, estimular la exudación de suero en la saliva mediante la colocación de un sialogogo como el ácido cítrico o goma de mascar en la boca. Una gota de limón sin azúcar es conveniente para los pacientes VIH-1 que con frecuencia son desdentados y no puede masticar goma de mascar. Swallow, según sea necesario durante los primeros 3 minutos, y recoger la saliva toda la boca en un recipiente con tapa para el próximo 3 min. Esto proporcionará aproximadamente 2 ml de saliva. Usar inmediatamente o almacenar a -80 ° C.
  2. MANEJO DE SALIVA: Si la muestra congelada, descongelar a 37 ° C y el lugar en el hielo. Almacenar espécimen fresco o descongelado a 2-4 ° C no más de 3 días. Hacer la saliva no vórtice y evitar pipeteado mucina que no contiene suero exudado. Use precauciones básicas cuando manipulen la saliva http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .

3. Microplacas Set-up

  1. BUFFER: Las mediciones se realizaron por triplicado. A cada pocillo de una placa de microtitulación se añade 130 l de TBS.
  2. MUESTRAS: Para cada pocillo de ensayo, se añadieron 20 l de saliva para un volumen final de 150 l / pocillo. Mezclar con la pipeta sin introducir burbujas.
  3. CONTROLES: El control positivo contiene PPE, pero la saliva no. El control negativo contiene la saliva, pero no PPE.To el control positivo se añadieron 20 l de TBS. Para el control negativo y se añadieron 20 l de saliva.
  4. INCUBACIÓN PPE: Agite la solución PPE funcionando bien. Añadir 50 l de trabajo PPE solución a cada pocillo con exclusión de los pocillos de control negativo. A los pocillos de control negativo, se añaden 50 l de TBS. Incubar 10 min a 23 ° C.
  5. Incubación del substrato: Añadir 50 l SA 3 solución de NA de trabajo a cada pocillo. Incubar 45 min a 23 ° C.
  6. Azul de Coomassie. Añadir 50 l de solución de azul de Coomassie de trabajo
  7. Lectura: Lea la absorbancia en el lector de microplacas, una de 405 nm para detectar SA 3 división NA que representa activa α 1 PI y A 595 nm para la detección de Coomassie azul que representa el contenido de proteína.

4. Calcular α 1 Índice de PI

  1. Normalizar LA MEDIA A 405 nm y 595 nm A: Por cada tres ejemplares, calcular la media. Restar la media del control negativo de la media de la pieza. Para minimizar la placa a placa de variación, la normalización de los promedios, dividiendo cada término medio entre el promedio de muestras de control positivo de la siguiente manera:

figure-protocol-1

  1. CALCULAR EL α 1 PI INEX: Dividir el normalizada A 405 nm por las normalizadas A 595 nm:

figure-protocol-2

5. Los resultados representativos

Para determinar si la α-test podría ser adecuado para su uso como prueba de detección de punto de atención para vigilar los recuentos de CD4 en endémicas, las regiones con recursos limitados, la saliva estimulada se obtuvieron de 20 mujeres y 11 hombres VIH-1 clínica de los sujetos para asistir a rutina de cuidado en el Camerún. De acuerdo con observaciones preliminares durante el desarrollo de la α-prueba con la saliva recogida en Nueva York, la α 1 Índice de PI en la saliva recogida en Camerún correlaciona con recuentos de células CD4 (R 2 = 0,91, p <0,0001. N = 31). La relación se define por una curva sigmoidea 3-parámetro que es consistente con una relación dosis-respuesta (Figura 2A). La confianza del 95% y los intervalos de predicción se representan con líneas azules y rojas, respectivamente (Figura 2B).

Enun estudio previo, se determinó que las células CD4 + T presentan ciclos sinusoidales con una periodicidad de 23 ± 3,5 días en sujetos VIH-1 y en sujetos con la versión heredada de la deficiencia de α 1 PI (PIZZ) 3. Se muestra aquí es un ejemplo representativo de la generada por ordenador análisis de la curva sinusoidal de las células CD4 bicicleta en un no-VIH-1 exhibe 27 controles sanos periodicidad días (Figura 3).

Generada por computadora análisis de la curva sinusoidal de las células CD4 + T cambios celulares en 6 sujetos dieron valores de pico a pico de amplitud y el eje de oscilación 3. Como era de esperar, el eje de oscilación se correlacionó con la amplitud (R 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6) (Figura 3B). En los pacientes que se CD4 bajos recuentos de células T +, los cambios cíclicos en el recuento de CD4 de células T eran pequeños, y en pacientes con CD4 + altos recuentos de células T, los cambios cíclicos eran grandes.

Debido a que ellínea de regresión se muestra en la Figura 2 estima que el eje de oscilación y el eje de oscilación está correlacionada con la amplitud, la amplitud puede ser calculado por la línea de regresión así estimar la distancia por encima y por debajo de los CD4 de la línea de regresión + células T se espera que variar debido a (véase la figura 3C). La superposición de la amplitud calculada en la Figura 3C y el intervalo de confianza calculado en la Figura 2B, se encontró que la amplitud (línea verde) está dentro del 95% del intervalo de confianza (línea azul) (Figura 3D).

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Figura 1. Resumen del procedimiento: El ácido cítrico Coloque en la boca y recoger la saliva. Añadir la saliva diluida a los pocillos de una microplaca por triplicado. Añadir PPE a cada pocillo y se incuba durante 15 min a 23 ° C. Añadir el sustrato PPE a cada pocillo y se incuba durante 45 min a 23 ° C. Añadir Azul de Coomassie y se leyeron a 405 nm para detectar la actividad del PPE y a 595 nm para detectar la proteína.

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Figura 2. Comparación de la α-test con el método de enumeración de CD4 estándar. A) La α-test se realizó por la cuantificación de la α 1 Índice de PI en la saliva estimulada toda la boca. Recuentos de CD4 se realizaron en un laboratorio médico independiente mediante citometría de flujo estándar. Sangre por citometría de flujo y la saliva se recogieron en la visita a la clínica misma. La relación entre la α 1 Índice de PI y los recuentos de CD4 fue definida por una curva sigmoidea de 3 parámetros (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 31). B) La confianza del 95% y los intervalos de predicción se muestran en azul y rojo líneas, respectivamente.

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Figura 3. La precisión del cálculo de CD4 counts utilizando el Index.A α1PI) células T CD4 + mostraron ciclo sinusoidal con periodicidad de 27 días en un control no-VIH-1 saludable. El eje de oscilación se representa (línea punteada roja). B) generado por ordenador de análisis de onda sinusoidal de CD4 se usan ciclos de células T para calcular la amplitud de pico a pico y el eje de oscilación en 4 sujetos VIH-1, 1 no-VIH -1 Pizz tema, y la no-VIH-1 control sano se muestra en la parte A. La relación entre T CD4 + amplitud de la celda y el eje de oscilación fue definida por la curva sigmoidea de 3 parámetros (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6). C) La relación sigmoidal entre la amplitud y el eje de oscilación deriva en parte B) se utiliza para calcular la amplitud esperada (líneas verdes) de puntos a lo largo de la línea de regresión (línea negro) de la Figura 2. D) La amplitud esperada intervalo (líneas verdes) fue significativamente diferente de la del intervalo de confianza 95% (líneas azules) como se determina por el ensayo de Mann Whitney suma de rangos (basado en una comparación de la diferencia media entre el intervalo de confianza del 95% y la línea de regresión (63 células / l) y la mediana de la diferencia entre la línea de amplitud y la línea de regresión (37 células / l), p = 0,001).

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Discusión

Suero sin diluir contiene la mediana de 36 mM α 1 PI y 3,6 mM α 2 macroglobulina (α 2 M), una diferencia de 10 veces 8. Ambas proteínas competir por la unión a EPI. Estas dos características, la concentración y la afinidad del PPE, se han explotado para desarrollar un método que es capaz de medir específicamente α 1 PI en el suero normal en presencia de competir α 2 M 8. Este método puede detectar cantidades tan pequeñas como 50 μ nM 1

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

La investigación fue apoyada por la Fundación de Investigación de Harry Winston.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo
Sialogogo, 0,05 M de ácido cítrico Caramelos Sugarfree EDA, 4900 trasero N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 Sin azúcar gotas de limón
Elastasa pancreática porcina, de tipo 1 (EC 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 E1250
Succinil-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilida Sigma-Aldrich S4760
Coomassie Brilliant Blue R-250 Sigma-Aldrich B7920
El cultivo de tejidos tratados, microplacas de 96 pocillos Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 35-3072
Lector de microplacas con filtros de 405 nm y 595 nm MTX Lab Systems, Inc. 8456 Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 Dynex P97277

Referencias

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