De alto rendimiento mapeo físico de cromosomas utilizando automatizado In situ La hibridación

Summary

Los ensamblajes de genomas basados en tecnologías de secuenciación de ADN masivamente paralelas suelen estar muy fragmentados. El desarrollo de mapas cromosómicos físicos puede mejorar potencialmente los ensamblajes del genoma. Aquí, demostramos enfoques innovadores para la preparación de cromosomas, la hibridación fluorescente in situ y la obtención de imágenes que aumentan significativamente el rendimiento del desarrollo del mapa físico.

Abstract

Se espera que en los próximos 5 años se lleven a cabo proyectos para obtener secuencias del genoma completo de 10.000 especies de vertebrados¹ y de 5.000 especies de insectos y artrópodos relacionados². Por ejemplo, la secuenciación de los genomas de 15 especies de mosquitos de la malaria se está realizando actualmente utilizando una plataforma Illumina^3,4. Este conglomerado de especies de Anopheles incluye tanto vectores como no vectores de la malaria. Cuando los ensamblajes del genoma estén disponibles, los investigadores tendrán la oportunidad única de realizar análisis comparativos para inferir cambios evolutivos relevantes para la capacidad vectorial. Sin embargo, ha demostrado ser difícil utilizar lecturas de secuenciación de próxima generación para generar ensamblajes de genomas de novo de alta calidad⁵. Por otra parte, los ensamblajes genómicos existentes para Anopheles gambiae, aunque obtenidos utilizando el método de Sanger, están separados o fragmentados^4,6.

El éxito de los análisis genómicos comparativos será limitado si los investigadores se ocupan de numerosos contigs de secuenciación, en lugar de con ensamblajes de genomas basados en cromosomas. Las secuencias fragmentadas y no mapeadas crean problemas para los análisis genómicos porque: (i) las brechas no identificadas causan una anotación incorrecta o incompleta de las secuencias genómicas; (ii) las secuencias no mapeadas conducen a confusión entre genes parálogos y genes de diferentes haplotipos; y (iii) la falta de asignación cromosómica y de orientación de los contigs de secuenciación no permite reconstruir la filogenia del reordenamiento y estudiar la evolución cromosómica. El desarrollo de mapas físicos de alta resolución para especies con genomas recién secuenciados es una inversión oportuna y rentable que facilitará la anotación del genoma, el análisis evolutivo y la resecuenciación de genomas individuales de poblaciones naturales^7,8.

Aquí, presentamos enfoques innovadores para la preparación de cromosomas, la hibridación fluorescente in situ (FISH) y la obtención de imágenes que facilitan el desarrollo rápido de mapas físicos. Usando An. gambiae como ejemplo, demostramos que el desarrollo de mapas cromosómicos físicos puede mejorar potencialmente los ensamblajes del genoma y, por lo tanto, la calidad de los análisis genómicos. En primer lugar, utilizamos un método de alta presión para preparar las tiras de cromosomas de politeno. Este método, desarrollado originalmente para Drosophila⁹, permite al usuario visualizar más detalles en los cromosomas que la técnica de aplastamiento regular¹⁰. En segundo lugar, se utiliza un sistema front-end totalmente automatizado para FISH para el mapeo físico del genoma de alto rendimiento. El sistema automatizado de tinción de portaobjetos ejecuta múltiples ensayos simultáneamente y reduce drásticamente el tiempo de manipulación¹¹. En tercer lugar, un sistema automático de imágenes fluorescentes, que incluye una platina de deslizamiento motorizada, escanea y fotografía automáticamente los cromosomas etiquetados después de FISH¹². Este sistema es especialmente útil para identificar y visualizar múltiples placas cromosómicas en la misma diapositiva. Además, el proceso de escaneo captura un resultado FISH más uniforme. En general, el protocolo de mapeo físico automatizado de alto rendimiento es más eficiente que un protocolo manual estándar.

Protocol

1. Preparación de cromosomas politénicos de alta presión a partir de células nodrizas ováricas

1. Diseccionar hembras de Anopheles semigrávidas a las 25 horas después de la alimentación con sangre bajo un microscopio de disección y fijar los ovarios en una solución fresca modificada de Carnoy con metanol (metanol al 100%: ácido acético glacial, 3:1). En esta etapa, los ovarios se encuentran en la etapa III de desarrollo de Christophers, cuando los folículos tienen una forma ovalada y un área transparente con células nodrizas dentro de los folículos tiene una forma redonda¹³. Coloque los ovarios de aproximadamente cinco hembras en 500 μl de solución de Carnoy modificada en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y manténgalos a temperatura ambiente durante 24 horas. Transfiera los ovarios a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo.
2. Prepare la solución de Carnoy modificada con etanol (100% etanol: ácido acético glacial, 3:1) y 50% de ácido propiónico justo antes de hacer los portaobjetos. Coloque un par de ovarios en un portaobjetos libre de polvo en una gota de la solución de Carnoy modificada. Divida los ovarios en aproximadamente 6 secciones con agujas de disección y colóquelas en gotas de ácido propiónico al 50% en portaobjetos limpios bajo un microscopio estereoscópico Leica MZ6 de disección. Use una diapositiva separada para cada sección.
3. Separe los folículos, diseccione con agujas y limpie el tejido restante con papel de filtro o toalla de papel bajo un microscopio de disección. Agregue una nueva gota de ácido propiónico al 50% a los folículos y déjelos reposar durante 3-5 minutos a temperatura ambiente. Coloque un cubreobjetos encima de la gota de ácido propiónico al 50%. Deje reposar el portaobjetos durante aproximadamente 1 minuto.
4. Envuelva el portaobjetos con papel de filtro y plástico. Con una herramienta rotativa Dremel 200 con un accesorio Flex-Shaft y una punta de plástico blando ajustada entre 3000 y 5000 RPM, extraiga los folículos girando la punta en círculos y presionando ligeramente el cubreobjetos para distribuir uniformemente los núcleos. Este paso debería tomar aproximadamente 1 minuto. Compruebe la calidad de la dispersión con un microscopio de fase CX41 de Olympus utilizando un objetivo 20x.
5. Prepare un sándwich colocando un cubreobjetos adicional junto al cubreobjetos que cubre los cromosomas y cúbralos con un segundo portaobjetos de microscopio. Esto reduce la posibilidad de aplastar la corredera en el tornillo de banco. Envuelva los portaobjetos con una lámina de plástico que viene en recipientes de vidrio para portaobjetos y papel de filtro para sujetar el sándwich y proteger el portaobjetos de arañazos debido al tornillo de banco.
6. Aplique presión a los deslizadores a través de un tornillo de banco mecánico. Una presión de 85-120 pulgadas-libras es suficiente y se logra mediante el uso de una llave dinamométrica. Este paso es necesario para aplanar los cromosomas tanto como sea posible.
7. Retire el segundo portaobjetos del microscopio y el cubreobjetos adicional. Calentar el portaobjetos con el cubreobjetos que cubre los cromosomas a 55 °C en un sistema de desnaturalización/hibridación del portaobjetos durante 10-15 minutos para aplanar aún más los cromosomas. Sumerja el portaobjetos en nitrógeno líquido durante al menos 15 segundos y, cuando se haya detenido el burbujeo, proceda a quitar rápidamente el cubreobjetos con una cuchilla de afeitar. Coloque inmediatamente los portaobjetos en etanol frío al 50% durante 5 minutos. Deshidratar portaobjetos en etanol al 70%, 90%, 100% durante 5 minutos cada uno. Toboganes de secado al aire.

2. FISH utilizando un sistema automatizado de tinción de portaobjetos

Program se configura con el sistema automatizado de tinción de portaobjetos Xmatrx para ejecutar los siguientes pasos, excepto el etiquetado de la sonda. El protocolo detallado de etiquetado de traslación de muescas se describe en la documentación proporcionada con la ADN polimerasa de Fermentas.

1. Antes de la FISH, prepare sondas fluorescentes marcando el ADN genómico BAC con un fluorocromo utilizando un protocolo de traducción de nicks. Mezcle 1 μg de ADN, 0,05 mM de dATP, dCTP y dGTP sin marcar y 0,015 mM de dTTP, 1 μl de Cy3- o Cy5-dUTP, 0,05 mg/ml de BSA, 5 μl de tampón de traducción de nick-translation 10x, 20 unidades de ADN polimerasa I, 0,0012 unidades de DNasa I y agua libre de nucleasas hasta 25 μl. La relación ADN polimerasa I/DNasa I se selecciona empíricamente para obtener sondas con un rango de tamaño de 300 a 500 pb. Incubar la mezcla a 15 °C durante 1 hora.
2. Coloque los portaobjetos y los reactivos en el sistema automatizado de tinción de portaobjetos Xmatrx e inicie el programa para ejecutar los siguientes pasos. Aplicar 800 μl de 1x PBS durante 20 min. Sopla los toboganes con aire. Realice la fijación de formalina aplicando 450 μl de formalina al 4% en 1x PBS durante 1 minuto, seguido de lavados con etanol al 100% durante 1 segundo dos veces y durante 2 minutos una vez. Sopla los toboganes con aire.
3. El calor se desliza a 45 °C durante 2 minutos para evitar burbujeos al aplicar las sondas. Aplique 20 μl de las sondas de ADN, agregue gotas de aceite mineral para evitar la evaporación de una solución de hibridación y coloque un cubreobjetos encima. Desnaturalice los cromosomas y las sondas de ADN calentando portaobjetos a 90 °C durante 10 min.
4. Para la hibridación, incubar los portaobjetos a 42 °C durante 14 horas con los cubreobjetos. La solución de hibridación consta de 2x SSC, 100 mM de fosfato de sodio, 1x solución de Denhardt, 100 μg/ml de azida de sodio y 10% de sulfato de dextrano en formamida.
5. Para lavados estrictos, se calientan a 42 °C durante 2 min, se quitan los cubreobjetos, se lavan 2x SSC durante 1 seg 4 veces. Sopla los toboganes con aire. Aplicar 800 μl de SSC 0,4x a 42 °C durante 10 min 2 veces. Lave los portaobjetos en 2x SSC a 25 °C durante 10 min.
6. Realice la tinción cromosómica aplicando 50 μl de 1 μM de YOYO-1 en 1x PBS. Aplique gotas de aceite mineral para evitar la evaporación de la solución de tinción, coloque cubreobjetos e incube a 25 °C durante 10 min. Retire los cubreobjetos, lave los portaobjetos en 2x SSC durante 1 segundo 4 veces. Sopla los toboganes con aire. Aplicar 15 μl de reactivo antidecoloración ProLong Gold. Ponte cubreobjetos.

3. Lectura de diapositivas con un sistema automático de imágenes fluorescentes

Esta sección detalla el uso del software Duet, que viene de serie con el sistema de escaneo automatizado ACCORD PLUS. Las instrucciones comienzan después de encender en este orden: fuente de alimentación Olympus U-RFL-T para una bombilla halógena, computadora Dell precision T3500, microscopio Olympus BX61 con una cámara conectada Olympus U-CMAD3.

1. Para configurar 10x Pre-Scan, abra el software Duet en el sistema de escaneo automatizado ACCORD PLUS. Haga clic en el botón "En línea". Ingrese el nuevo ID de caso y asigne un ID de diapositiva. Haga clic en el punto etiquetado como "BF". Esta es la opción de campo claro. Establezca una opción de escaneo en "10x Prescan". Usa "círculo de 2500x", "círculo de 10000x" o "rectángulo". Haga clic en "Configurar y ejecutar" para un escaneo previo de 10x.
2. Haga clic en el botón "Aceptar" para ejecutar 10x Pre-Scan. Siga las instrucciones para ajustar el escaneo correctamente. Haga clic en "Finalizar" para iniciar el escaneo. Presione la pestaña "Principal" para volver a la pantalla principal. Haga clic en el botón "Sin conexión". Busque el ID de caso y el ID de diapositiva que se asignaron y haga clic en "Escaneo sin conexión". En el cuadro negro en el área superior izquierda, haga clic en una flecha y seleccione "10x Prescan". Usando las flechas (< || Δ > también conocidos como botones "atrás", "pausa", "reproducir", "avanzar"), recorra las imágenes escaneadas.
3. Después de encontrar una imagen de interés, haga doble clic en la pantalla en el centro de la región de destino y presione "Ajustar". Esto se dirigirá a una imagen para capturarla más adelante. Después de seleccionar todos los objetivos, haga clic en "Clasificar". Seleccione "10x Prescan". Haga clic con el botón derecho en una imagen y tenga la oportunidad de clasificar las imágenes. Selecciona "Politeno".
4. Configure 40x Pre-Scan en el software Duet. Haga clic en "Principal" para volver al menú principal. Selecciona "En línea" de nuevo. Seleccione una diapositiva. Cambia "BF" por "FL". Cambie el nombre de la tarea a "Revisit-X40-RG". Cambie la sección justo debajo de la última configuración a "Volver a visitar TODO". Haga clic en "Establecer y ejecutar". Presione "Aceptar". Vuelva a seguir las indicaciones para configurar la automatización. Haga clic en el botón "Comenzar a hacer coincidir las vistas" para hacer coincidir imágenes de 10x y 40x. Haga clic en "Finalizar" para iniciar el escaneo. Una vez hecho esto, haz clic en "Clasificar" y mira las imágenes.

4. Resultados representativos

La figura 1 representa gráficamente el esquema de la preparación del cromosoma de alta presión. Este paso implica el proceso de aplastamiento y aplanamiento de los cromosomas con una herramienta Dremel y un tornillo de banco mecánico, así como la visualización de los cromosomas con un microscopio de contraste de fase. La Figura 2 ilustra la hibridación de una sonda marcada con fluorescencia para dirigirse al ADN en las preparaciones de portaobjetos cromosómicos utilizando un sistema automatizado de tinción de portaobjetos, el uso de un microscopio de barrido automatizado para visualizar y mapear las sondas después del experimento FISH, y la colocación y orientación de andamios genómicos en los cromosomas.

Las preparaciones de cromosomas politénicos de células nodrizas ováricas de hembras de An. gambiae se realizaron utilizando la técnica de alta presión. Este método no daña ni cambia la mayor parte de la estructura cromosómica (Figura 3). Aplana los cromosomas doblados y, por lo tanto, revela bandas finas ocultas que no se ven en las preparaciones regulares (Figura 4).

Las sondas utilizadas en este protocolo son clones de ADN BAC genómico obtenidos de una biblioteca ND-TAM BAC generada a partir del ADN de la cepa PEST de An. gambiae. El ADN genómico de esta biblioteca se extrajo de larvas de primer estadio recién eclosionadas de ambos sexos. En la Figura 5 se muestran los resultados de FISH utilizando clones de BAC hibridados con cromosomas politenos de An. gambiae. Este procedimiento se llevó a cabo utilizando el sistema automatizado de tinción de portaobjetos Xmatrx. Utilizando un fotomapa citogenético para An. gambiae¹⁰, dos clones de BAC, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) y BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), se localizaron en las subdivisiones 16C y 16D del brazo 2R, respectivamente. Sin embargo, la búsqueda BLAST contra el ensamble ¹⁴ de la cepa AgamP3 de An. gambiae PEST identificó las secuencias homólogas a 102B24 y 142O19 en las subdivisiones 16B y 17A del brazo 2R, respectivamente (Tabla 1). Por lo tanto, la correspondencia entre las coordenadas genómicas y las subdivisiones citogenéticas ahora se puede ajustar de acuerdo con nuestros datos de mapeo. La búsqueda de BLAST contra los ensamblajes de genoma de la forma M y la forma S de An. gambiae encontró que los dos clones de BAC se encuentran en diferentes contigs, pero en los mismos andamios dentro de cada forma (Tabla 1). Los contigs identificados ahora se pueden asociar con ubicaciones cromosómicas específicas. Por otra parte, los andamios identificados ahora pueden ser orientados adecuadamente dentro de las subdivisiones citológicas 16CD. Curiosamente, las distancias entre las secuencias 102B24 y 142O19 en los andamios son de 1.892.981 pb, 1.658.391 pb y 1.688.426 pb en los ensamblajes del genoma de la cepa PEST, en forma M y en forma S, respectivamente. Debido a que la cepa PEST es un híbrido entre las formas M y S, es probable que esta diferencia se deba a un ensamblaje incorrecto del genoma PEST.

BAC (adhesión)	CEPA-PEST AgamP3 Coordenadas	Forma M contigs Coordenadas	Forma M andamios Coordenadas	Forma S contigs Coordenadas	Forma S andamios Coordenadas
102B24 (BH372694)	2R:AAAB0100 8844_26 (16B) 43.681.342- 43.681.874	ABKP020247 53.1 32,513- 33.045	EQ090167.1 1.858.377- 1.858.909	ABKQ010123 32.1 4.299- 4.832	EQ099711.1 215.891- 216.424
102B24 (BH372701)	2R:AAAB0100 8844_28 (16B) 43.788.213- 43.788.969	ABKP020247 51.1 24,816- 25.575	EQ090167.1, 1.772.683- 1.773.442	ABKQ010123 35.1 27.782- 28.540	EQ099711.1, 305.514- 306.272
142O19 (BH368698)	2R:AAAB0100 8805_5 (17A) 45.428.580- 45.429.264	ABKP020247 01.1 2,499- 3.185	EQ090167.1 315.806- 316.492	ABKQ010123 76.1 49,242- 49.942	EQ099711.1 1.791.625- 1.792.325
142O19 (BH368703)	2R:AAAB0100 8805_8 (17A) 45.560.099- 45.574.323	ABKP020220 17.1 30.971- 32.469	EQ090167.1 200.518- 202.016	ABKQ010123 79.1 27.760- 28.508	EQ099711.1 1.903.569- 1.904.317

Tabla 1. Resultados de BLAST de las secuencias de extremo de BAC contra los ensamblajes del genoma de An. gambiae.

Figura 1. Representación esquemática de la preparación cromosómica de alta presión. Los ovarios de los mosquitos se muestran en la etapa correcta de desarrollo.

Figura 2. Un esquema que representa FISH automatizado, escaneo de portaobjetos y mapeo cromosómico de andamios genómicos.

Figura 3. Dispersión del cromosoma politénico 3 de An. gambiae obtenida mediante la técnica de alta presión. 3L y 3R marcan los brazos izquierdo y derecho en sus telómeros. El PH y el IH indican heterocromatina pericéntrica e intercalar, respectivamente.

Figura 4. Comparación de cromosomas politénicos de An. gambiae preparados mediante la técnica tradicional (arriba) y de alta presión (abajo). Las imágenes cubren las subdivisiones 29A-30E del brazo 3R (A) y 43D-46D del brazo 3L (B).

Figura 5. FISH de clones de BAC a cromosomas politénicos de An. gambiae. A) Hibridación de 102B24 (señal roja) con el brazo 2R. B) FISH bicolor de 102B24 (señal roja) y 142O19 (señal azul) a las subdivisiones 16C y 16D del brazo 2R estirado, respectivamente. Las flechas indican señales de hibridación de clones de BAC marcados con Cy3 (rojo) y Cy5 (azul). C-la región centromérica. a/+ muestra la inversión heterocigota 2La. Los cromosomas se contratiñeron con el fluoróforo YOYO-1.

Discussion

El paso más crítico del procedimiento de alta presión es el aplastamiento adecuado de las células nodrizas ováricas aisladas en la etapa III de desarrollo ovárico de Christophers¹³. El aplastamiento inadecuado puede conducir a una dispersión insuficiente de los cromosomas, lo que puede causar problemas al tratar de determinar las ubicaciones de la sonda después de FISH. Si los cromosomas están demasiado aplastados, pueden romperse o alargarse hasta el punto en que se pierden los patrones de bandas. La producción de múltiples portaobjetos debería conducir a una consistencia al intentar aplastar los portaobjetos con la herramienta Dremel, lo que aumentará la eficiencia general de la producción de portaobjetos. La técnica de alta presión se desarrolló por primera vez para las glándulas salivales recién aisladas de D. melanogaster⁹. Sin embargo, los ovarios de los mosquitos se conservan rutinariamente en una solución fijadora de Carnoy modificada (3 metanol: 1 ácido acético glacial por volumen) antes de que se utilicen para preparaciones cromosómicas. Por lo tanto, modificamos el protocolo de alta presión existente para que sea adecuado para los cromosomas politénicos de células nodrizas ováricas fijas del mosquito de la malaria An. gambiae. Debido a que la alta presión se aplica utilizando un tornillo de banco de precisión que posee una superficie de trabajo altamente paralela de todo el portaobjetos, se necesita mucho menos tiempo para preparar la calabaza cromosómica que usar una técnica de golpeteo tradicional con el borrador de un lápiz.

Otros pasos importantes incluyen empapar suficientemente los folículos en ácido propiónico al 50% y calentar el portaobjetos. Ambos pasos son esenciales para ayudar a aplanar los cromosomas. Si se descuidan, los cromosomas pueden aparecer brillantes después de la deshidratación, lo que potencialmente conduce a una sobreabundancia de fondo que puede confundirse con una señal en FISH. La técnica de aplastamiento a alta presión también funciona bien utilizando las mismas soluciones al hacer preparaciones de cromosomas mitóticos. La propagación y el aplanamiento adicionales ayudan a expresar mejor los cromosomas de sus núcleos. Agregar la misma presión debería aplanarlos en consecuencia para permitir mediciones y una resolución potencialmente mejor de las bandas visibles por la tinción. Los detalles sobre el aislamiento de los cromosomas mitóticos de los mosquitos se dan en otra parte¹⁵. Aunque las preparaciones regulares de calabaza son suficientes para muchos propósitos, incluidos FISH ¹⁶ e inmunotinción¹⁷, el método de alta presión no solo reduce la variación potencial de un portaobjetos a otro, sino que también aumenta la calidad general de los cromosomas, lo que lleva a un mayor detalle al mapear los cromosomas. Este procedimiento también se puede utilizar para preparar portaobjetos de membrana cromosómica politénicos para microdisección por captura láser.

Las limitaciones del método de alta presión incluyen la rotura del portaobjetos y el estiramiento excesivo de los cromosomas. La rotura de la corredera causada por ejercer demasiada presión sobre la corredera a través del tornillo de banco es posible, pero se limita mediante el uso de las presiones indicadas en el artículo. En caso de estiramiento excesivo de los cromosomas, si se aplica la herramienta Dremel a la diapositiva durante un período prolongado de tiempo, existe la posibilidad de que los cromosomas se estiren demasiado y pierdan resolución. Esto se puede remediar aplicando la herramienta durante un breve período de tiempo, verificando bajo el microscopio y aplicando más tiempo con la herramienta Dremel si los cromosomas no están lo suficientemente dispersos.

Un protocolo FISH tradicional incluye una serie de pasos de lavado e incubación, que generalmente duran de 5 a 20 minutos y requieren una atención casi total de un investigador durante toda la duración del experimento. Además, el número de portaobjetos que se pueden manejar manualmente suele limitarse a unos pocos portaobjetos en un experimento determinado. Por el contrario, un sistema automatizado de tinción de portaobjetos realiza todos los pasos (incluido el lavado, la incubación, la aplicación de la sonda, la desnaturalización, la hibridación, la aplicación y eliminación del cubreobjetos) automáticamente. Esto libera hasta 6-8 horas de trabajo para un investigador en un experimento FISH. Además, un sistema FISH automatizado puede aumentar significativamente el rendimiento. Por ejemplo, el sistema Xmatrx es capaz de procesar hasta 40 ensayos en portaobjetos de preparación individuales y hasta 80 ensayos en portaobjetos de preparación dobles simultáneamente. Entre las limitaciones de este sistema está que no es eficiente para un pequeño número de experimentos FISH, ya que requiere preparar grandes volúmenes de soluciones. Además, el protocolo FISH programado en el sistema puede requerir modificaciones y ajustes para nuevas aplicaciones.

Un sistema de escaneo de portaobjetos es una versión automatizada de un microscopio fluorescente. El movimiento automatizado de la platina y un panel de control de microscopio simple liberan el tiempo del investigador y hacen que operar el microscopio sea extremadamente simple. Por ejemplo, el software del sistema de escaneo ACCORD PLUS permite capturar fácilmente múltiples canales de fluorescencia y administrar fácilmente la adquisición de imágenes. Un ejemplo de esto es la inclusión de la captura z-stack, en lugar de tomar una sola imagen; El software captura una pila Z configurable de imágenes para garantizar que al menos una imagen permanezca enfocada. Aunque este sistema está hecho más para la adquisición de imágenes múltiples (muchas células en un solo portaobjetos), todavía hace que encontrar cromosomas en el portaobjetos sea mucho más fácil que navegar por el portaobjetos manualmente.

Tanto el sistema automatizado de tinción de portaobjetos como el sistema de escaneo se utilizan de forma rutinaria para el diagnóstico FISH de anomalías cromosómicas en células humanas por parte de las clínicas citogenéticas. En este estudio, desarrollamos un protocolo que utiliza estos sistemas automatizados para una aplicación de investigación básica. El protocolo automatizado de mapeo físico de alto rendimiento puede facilitar el desarrollo rápido de mapas cromosómicos físicos para cualquier especie de interés. Aunque, en este informe, usamos cromosomas politénicos para el mapeo físico, los cromosomas mitóticos también se pueden utilizar con estos sistemas. Sería útil que el protocolo se ajustara a los cromosomas mitóticos porque la mayoría de los organismos no desarrollan cromosomas politénicos legibles. Sin embargo, los cromosomas politénicos, cuando están disponibles, pueden proporcionar información útil sobre la correspondencia de los dominios funcionales del genoma con la estructura cromosómica con la resolución más alta. Los principios organizativos de los cromosomas politénicos, como los patrones de bandas e interbandas, se han comparado recientemente con los de los cromosomas regulares no politénicos (interfase)¹⁸. Por lo tanto, el mapeo físico detallado realizado en preparaciones cromosómicas de alta presión tiene el potencial de vincular secuencias de ADN a estructuras cromosómicas específicas como bandas, interbandas, bocanadas, centrómeros, telómeros y heterocromatina; por lo tanto, creando ensamblajes de genoma basados en cromosomas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
cubreobjetos para microscopio de 22x22 mm	Fisher	12-544-10
cubreobjetos para microscopio de 18x18 mm	Fisher	12-553-402
Ácido acético	Fisher	A491-212
Metanol	Fisher	A412-4
Ácido propiónico	Sigma-Aldrich	402907
Herramienta rotativa Dremel 200 con eje flexible accesorio	Rand		3" Mini Amoladora de Banco Multipropósito (con limitador de velocidad)
Especialmente diseñado 200 μ l puntas de plástico (bordes de plástico con cuentas) para la herramienta Dremel	Pipetman	F171300	Cortar y calentar el extremo graso de las puntas de pipeta Tornillo de
banco rápido recubierto de estaño	Fabricante de herramientas Avenger Gold MTC-200-1		Rectificado con precisión cuadrado y paralelo a 0.00025
Llave dinamométrica	Craftsman	44593
ThermoBrite Slide Sistema de desnaturalización/hibridación	Abbott Molecular	30-144110
Portaobjetos de barrera de 25 mm	Abbott Molecular	XT108-SL
Cubreobjetos de 25 mm	Abbott Molecular	XT122-90X
Xmatrx Sistema de tinción de portaobjetos automatizado	Abbott Molecular	08L46-001
MZ6 Microscopio estereoscópico Leica	Leica	VA-OM-E194-354	Se puede utilizar un microscopio estereoscópico diferente
Olympus CX41 Microscopio de fase	Olympus	CX41RF-5	Se puede utilizar un microscopio de fase diferente
Sistema de escaneo automatizado ACCORD PLUS	BioView (EE. UU.)	BV-5000-ACCP
10x PBS	Invitrogen	P5493
10% NBF (formalina tamponada neutra)	Sigma-Aldrich	HT501128
99% formamida	Fisher Scientific	BP227500
Sulfato de dextrano sal sódica	Sigma	D8906
20x Tampón SSC	Invitrogen	AM9765
Fosfato de sodio	Sigma-Aldrich	S3264
50x Solución de Denhardt	Sigma-Aldrich	D2532
Azida de sodio	Sigma-Aldrich	S2002
1 mM Solución de yoduro YOYO-1 (491/509) en DMSO	Invitrogen	Y3601
Reactivo antidecoloración ProLong Gold	Invitrogen	P36930
dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Fermentas	R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP	GE Healthcare PA53022	, PA55022
BSA	Sigma	A3294
ADN polimerasa I	Fermentas	EP0041
DNasa I	Fermentas	EN0521