Se describe una técnica sencilla y de bajo costo para la introducción de alta concentración de colorantes fluorescentes y sensible de calcio en las neuronas o cualquier aparato neuronal con una pipeta de succión de polietileno.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Cargando retrógrada de los nervios, panfletos, y las raíces espinales con tintes fluorescentes
En este artículo
Resumen
Resumen
Etiquetado retrógrada de las neuronas es un 1,2 anatómica método estándar que se ha utilizado también para cargar calcio y tintes sensibles al voltaje en neuronas 3-6. En general, los colorantes se aplican en forma de cristales sólidos o por inyección a presión local utilizando pipetas de vidrio. Sin embargo, esto puede resultar en la dilución de la intensidad colorante y etiquetado reducida, particularmente cuando se requieren varias horas para la difusión del colorante. Aquí se demuestra una técnica sencilla y de bajo costo para la introducción de colorantes fluorescentes y de iones sensibles a las neuronas con una pipeta de succión de polietileno llena de la solución de colorante. Este método ofrece una forma fiable para mantener una alta concentración del colorante en contacto con los axones en todo el procedimiento de carga.
Protocolo
Dextranos fluorescentes se han utilizado como herramientas anatómicas y para la actividad neuronal imagen 1-4. Campos et al, (2009) 4 publicó un protocolo para la aplicación de iones y sensibles al voltaje tintes de vías axonales con un enfoque en la médula espinal como un sistema modelo. Aquí se describe un procedimiento más detallado para la aplicación de tinte fluorescente y / o de iones sensibles a las raíces cortadas ventrales, raíces dorsales o cualquier tracto neuronal de la médula espinal para los estudios in vitro optophysiological y morfológicas.
1. Tipo I y Tipo II Pipetas
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Se describe aquí un protocolo simple y rentable para la introducción de colorantes en las neuronas, los nervios y tractos espinales. Este método consiste en exponer identificados vías anatómicas a una solución de tinte altamente concentrada para la duración del proceso de carga. Esto se traduce en el etiquetado retrógrada del sitio de destino con poca experiencia en comparación con microinyecciones, la aplicación de baños y técnicas de electroporación. Sin embargo, el método está limitado a los sitios en el sistema n.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el programa intramural de los Institutos Nacionales de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares de los Institutos Nacionales de Salud. También nos gustaría agradecer al Dr. George Mentis por sus contribuciones anteriores al método y los datos de la Figura 3.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Nombre del Material Empresa Número de catálogo Comentarios | ||||
| Tubos | PE90 (IDxOD: 0.034 "x0.050", Espesor de pared: 0.008 ") | Clay Adams Marca Intermedic | 427421 | Por tipo I y tipo II pipetas |
| NSF-51 (IDxOD: 1/16x1/8; Espesor de pared: 1/32) | PharMed BPT, Cole-Parmer | AY242002 | Para los tubos flexibles | |
| Jeringa | 1 ml jeringa de insulina U-100 | Becton Dickenson | 329650 | |
| Aguja | 19G x1-1/2 "Metal cubo de la aguja | MONOJECT | 200136 | Conexión de Tipo II pipeta a la jeringa |
| El alcohol de la lámpara | ||||
| Llave de paso | Llave de tres vías con adaptador Luer Slip Mujer | Baxter Healthcare Corp. | 2C6241 | Utilice con la jeringa |
| Soporte | Titular de la H-1 electrodo | Narishige | H-1/12 | |
| Imán soporte | Narishige | GJ-8 | ||
| Micromanipulador | Narishige | M-3333 | ||
| Pinzas | S & T DUMONT suiza 00632-11 | DUMONT | JF-5 TC |
* Estos son los materiales sugeridos. Puede ser reemplazado por cualquiera de los productos compatibles
Referencias
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluoresce....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
