La inmovilización de las planarias, irradiación parcial, y el trasplante de tejido

Resumen

Un método eficaz para el injerto tejido de tamaño definido y constante entre planaria se describe. También se incluye una descripción de cómo la técnica de inmovilización utilizado para el trasplante se puede adaptar, en conjunción con los escudos de plomo, para la irradiación parcial de animales vivos.

Resumen

La planaria, un gusano plano de agua dulce, ha demostrado ser un potente sistema para la disección de la regeneración de los metazoos y ^1,2 de células madre biología. La regeneración de las planarias de todos los tejidos perdidos o dañados es posible gracias a las células madre adultas denominado neoblastos ^3. A pesar de estas células madre han sido definitivamente demostrado ser pluripotentes y singularmente capaz de reconstituir un animal entero ^4, la heterogeneidad en la población de células madre y la dinámica de sus comportamientos celulares siguen siendo en gran medida sin resolverse. Debido al gran número y amplia distribución de las células madre a través del plan corporal planaria, métodos avanzados para la manipulación de las subpoblaciones de células madre para el estudio molecular y funcional in vivo son necesarios.

El trasplante de tejidos y la irradiación parcial de dos métodos por los que se puede una subpoblación de células madre de las planarias aislados para estudios posteriores. Cada técnica tiene sus propias ventajas. Tel trasplante de tema permite la introducción de células madre, en un huésped ingenuo, que son intrínsecamente genéticamente distinta o han sido previamente tratados farmacológicamente. Alternativamente, la irradiación parcial permite el aislamiento de células madre dentro de un huésped, yuxtapuesto al tejido desprovisto de células madre, sin la introducción de una herida o cualquier violación de la integridad del tejido. El uso de estos dos métodos, uno puede investigar los factores celulares autónomos y no autónomos-que controlan las funciones de células madre, como la proliferación, diferenciación y migración.

Tanto el trasplante de tejido de ^5,6 y la irradiación parcial de ⁷ se han utilizado históricamente en la definición de muchas de las preguntas acerca de la regeneración de las planarias que permanecen en estudio en la actualidad. Sin embargo, estas técnicas han permanecido infrautilizada debido a la naturaleza laboriosa e inconsistente de los métodos anteriores. Los protocolos que se presentan aquí representan un gran paso adelante en la reducción del tiempo de unaND esfuerzo necesario para generar de forma reproducible un gran número de animales injertados o parcialmente irradiado con eficacias se aproximan al 100 por ciento. Cubrimos la cultura de los animales grandes, la inmovilización, la preparación para la irradiación parcial, el trasplante de tejido, y la optimización de la recuperación de los animales. Además, el trabajo descrito aquí se muestra la primera aplicación del método de irradiación parcial para su uso con la planaria más ampliamente estudiado, Schmidtea mediterranea. Además, el tejido eficiente de injerto en los gusanos abre la puerta a las pruebas funcionales de las subpoblaciones de células madre no tratados previamente o tratados en los ensayos de repoblación, lo que ha sido durante mucho tiempo el método estándar de oro para ensayar el potencial de células madre adultas en los mamíferos ^8. La amplia adopción de estas técnicas, sin duda, conducen a una mejor comprensión de los comportamientos celulares de células madre adultas durante la homeostasis del tejido y la regeneración.

Protocolo

Nota: este protocolo sugiere el uso de materiales potencialmente peligrosos (plomo y cloretona). Adquirir, lea y siga las MSDS para todos los materiales potencialmente peligrosos.

1. Cultura Animal, selección y preparación

1. Para el cultivo y uso de animales manejo del agua planaria (1X sales de Montjuïc ⁹⁾ y pipetas de plástico de transferencia.
2. Sexual biotipo Schmidtea mediterranea se puede utilizar cuando se crían en el laboratorio bajo condiciones de cultivo normales ^10. Para producir muestras asexuales de tamaño requerido, S. mediterranea elevado a temperatura ambiente bajo condiciones normales ⁹ debe ser alimentado al doble de la frecuencia normal de triples (2-3 veces por semana) durante uno o dos meses antes de usar. Alternativamente, los animales asexuales alimentados a la frecuencia normal puede ser mantenida a 10 grados Celsius indefinidamente a fin de aumentar su tamaño medio.
3. Seleccione los animales que se encuentran entre 1 a 2 cm delargo y ancho de 2 mm, se mueren de hambre los animales de 3-7 días antes de su uso.
4. Si se realiza algún tratamiento farmacológico o radiológicas en los ejércitos destinados, los donantes, o los animales irradiados parte, realizar el tratamiento (s) en este punto.
5. Si los tratamientos farmacológicos se llevaron a cabo la necesaria alimentación de los animales, los animales mueren de hambre otros 3 a 7 días antes de su uso.

2. Preparación de Soluciones y Materiales

1. Preparar una solución cloretona, un leve anestésico local, mediante la disolución de 0.1-0.2% w / v en agua cloretona planaria y enfriando la solución en hielo.
2. Si se realiza la irradiación parcial sólo, vaya al paso 2.7. Para el trasplante de tejido continúe con el paso 2.3.
3. El uso de un mechero Bunsen, doblar 0,75 mm de diámetro interior, que se utiliza para cortar el tejido del injerto, y 0,7 mm de diámetro exterior, que se utiliza para crear un agujero en el huésped que recibirá el injerto, tubos capilares a un ángulo de 90 ° a 1-2 cm desde el extremo de EAch tubo. Para guardar los materiales, doble ambos extremos de cada tubo capilar y romper por la mitad para producir dos herramientas. Tenga cuidado de no a las llamas de los confines de los tubos.
4. Corte los siguientes documentos a los tamaños indicados:
   • Negro filtro de papel (cortado en rectángulos de aprox. 2,5 cm x 1,5 cm)
   • Whatman # 3 filtro de papel (cortado en rectángulos de aprox. 2 cm x 0,5 cm)
   • Kimwipe (doblada y cortada en tacos aprox. 3 cm x 0,5 cm x 4 capas)
   • Rollos de papel de cigarrillos (retire la tira de goma de mascar y cortar en rectángulos de aproximadamente 3 cm x 2 cm)
5. Preparar modificada Holtfreter la solución (3,5 g / L de NaCl, 0,2 g / L de NaHCO _3, 0,05 g / l de KCl, 0,2 g / l MgSO _4, 0,1 g / l de CaCl _2, pH 7,0-7,5) y solución saturada de caseína Holtfreter y frío tanto a 4 ° C.
6. Adjunte una Kimwipe doblada a un cuadrado de Parafilm y colóquelo en un plato refrigerador Peltier o un dispositivo de refrigeración otra situada bajo un microscopio de disección. Saturar la Kimwipe con Holtf refrigeradasolución de reter y el lugar de dos rectángulos negros de papel de filtro en la Kimwipe.
7. Línea de cajas de Petri con papel Whatman n º 2 de papel de filtro. Humedezca el papel de filtro con una solución de Holtfreter y enfriar los platos de hielo. Para la irradiación parcial un plato más grande y el forro de papel de filtro puede ser utilizado.

3. Anestesia y Inmovilización

1. Llene una caja de Petri con una solución de cloretona refrigerados y los gusanos de pipeta en el plato. Para el transplante sólo anestesiar un anfitrión y un donante a la vez. Para la irradiación parcial de muchos (n> 10) los animales pueden ser anestesiados a la vez.
2. Deje que los gusanos en remojo en la solución cloretona hasta que se convierten inmóvil (5-10 min).
3. Enjuague los gusanos con la pipeta en un plato lleno de solución fría de Holtfreter.
4. Inmovilizar a los animales con la pipeta que sobre el papel negro de filtro saturado con la solución Holtfreter refrigerada y orientarlos parte ventral hacia abajo con unas pinzas. Si los animales son capaces de locOmote, tomar una solución Holtfreter exceso, ligeramente disminuir la temperatura de la placa Peltier o frío, o aumentar la duración del tratamiento cloretona.

4. La irradiación parcial

Nota: Siga estos pasos para preparar los animales para la irradiación parcial. Si se realiza el trasplante en su lugar, vaya a la sección 5.

1. Coloque una fría placa de Petri de la etapa 2.7 en el hielo en un cubo de hielo que se ajuste dentro de una principal fuente de irradiación de rayos-X.
2. Organizar animales anestesiados en una placa de Petri moviendo el papel negro filtro en el que están inmovilizados. El uso de pinzas para mover los gusanos anestesiados directamente los puede dañar.
3. Transporte dispuestos los animales a una parte superior-fuente de rayos X irradiador y situar el cubo de hielo de tal manera que la distancia desde el tubo de cátodo a los animales se reduce al mínimo, maximizando así la tasa de dosis efectiva.
4. Posición de liderazgo escudo (s) (Figura 1) entre los animales y el cátodo de TUbe como se desee. Los blindajes deben ser de 4,5 a 6 mm de espesor para permitir la atenuación del 97% a 99 de un 325kV haz de rayos X ^11.
5. Entregar dosis de rayos X. Si la ablación completa de células madre de la no-blindados regiones se desea, entregar 30 Gy o más con un irradiador de rayos-X. Para referencia, 30 Gy es equivalente a 3,6 minutos a 320 kilovoltios y 10 miliamperios en una precisión de Rayos-X Inc. XRAD320 con una distancia campo-fuente de 30 centímetros.
6. Inmediatamente después de la dosis se ha completado, el manejo de los gusanos por el filtro de papel negro, de transferencia de los animales en el agua fría planaria. Permitir que el agua planaria calentar a temperatura ambiente y los animales a sí mismos desalojar del papel de filtro negro. El procedimiento de irradiación parcial se ha completado.

5. Trasplante de tejido

1. Utilizando una pipeta de transferencia y fórceps, organizar anfitrión anestesiados y gusanos donantes en rectángulos separadas de papel de filtro negro en la Kimwipe que ha sido enfriado en el Peltier o enfriador de placas bajo el microscopio de disección.
2. El uso de un tubo de 0,75 mm de diámetro capilar interno cortar el enchufe del injerto del donante, y el uso de fórceps, colóquelo en un cabo de la forma en la parte del host. Si el material de injerto se queda atascado en el tubo capilar, desprender con una pinza.
3. El uso de un tubo de 0,7 mm de diámetro del capilar externa desconectar un enchufe de la máquina y el uso de pinzas de la posición del injerto en el agujero que se deja atrás.
4. Transferir el anfitrión trasplantado en su rectángulo negro papel de filtro en la placa de Petri preparada en la etapa 2.7.
5. Moje un pedazo de papel laminado con una solución saturada de caseína Holtfreter y colóquelo en la parte superior de la máquina trasplantado como diagramado en la Figura 2A.
6. Remoje cuatro trozos de papel de filtro en la caseína Holtfreter saturada de solución y se encajona en el de acogida trasplantado como diagramado en la Figura 2B.
7. Remoje cuatro fajos de Kimwipe corte en la caseína saturada Holtfreter la solución y las ponen sobreel papel de filtro de paso 5,6 (Figura 2B). Vuelva a colocar la tapa y coloque la placa de Petri en el hielo.
8. Transferir el gusano planaria de los donantes en el agua para recuperar, reparar y regenerar.
9. Cuando todos los trasplantes se han completado, coloque los gusanos trasplantados en un incubador de 10 ° C durante la noche.
10. A la mañana siguiente, teniendo cuidado de no perturbar el injerto, descubrir el gusano y la transferencia (en su papel de filtro negro) a una placa de Petri con agua planaria.
11. O permiten que el gusano se desplazan desde el papel de filtro o retírela con unas pinzas.
12. Cambie el agua planaria una vez cada 2-3 días.

6. Los resultados representativos

Inmediatamente después de la irradiación parcial de la planaria se parecen normales y no afectados. Dependiendo de la dosis suministrada y la geometría del escudo utilizado, el tejido irradiado puede retroceder e incluso desintegrarse ^7. Tejido blindado debe permanecer intacto. Follregresión del tejido debido y una pérdida de la integridad del tejido, un blastema se forman estructuras que faltan y se regeneran (Figura 3A). Si una amputación se realiza en la región parcialmente irradiado, el tejido irradiado serán rescatados (es decir, impide la regresión o de desintegración) (Figura 3B). En tanto la lesionada y la regeneración caso amputado se retrasará en comparación con un amputado no irradiado planaria (Figura 3C). Si una dosis de rayos-X de 30 Gy fue entregado y el animal parcialmente irradiado fue la ablación no lesionado, el éxito de células madre en un patrón que corresponde con el escudo de plomo que se utiliza puede ser confirmado 2 a 3 días después de la irradiación parcial de la hibridación in situ de las células madre marcador de Smed-piwi-1 ¹² (también conocido como smedwi-1) (Figura 4).

A la mañana después de un trasplante, un injerto con éxito del tejido trasplantado debe ser evidentes wn el tejido del huésped, que se han adherido tanto a las superficies dorsal y ventral de la máquina (Figura 5). Ocasionalmente, el injerto se adhiere sólo a la superficie ventral o dorsal. Si el trasplante fue completamente satisfactoria, ninguna señal de que el injerto será visible desde cualquiera de la superficie dorsal o ventral del huésped (Figura 5B). Poco después de un injerto exitoso de tejido no irradiado en un huésped que había sido extirpada de las células madre por la irradiación letal ^13,14, hibridación in situ para Smed-piwi-1 se ponen de manifiesto que las células madre están presentes principalmente en el injerto (Figura 5C ). Además, los injertos exitosos de los tejidos no irradiados letalmente irradiados en los ejércitos se traducirá en el rescate de los tejidos del huésped y la supervivencia a largo plazo de la serie ^15.

Figura 1. Disposición general de los componentes básicoss para la irradiación parcial. En un irradiador de rayos X con una parte superior posicionado fuente de rayos X (tubo catódico) la planaria anestesiados se coloca directamente debajo de la fuente de rayos X dentro del campo de irradiación. Con el fin de maximizar la tasa de dosis de rayos X, la distancia entre la planaria y la fuente de rayos X debe ser minimizado. Un protector de plomo debe colocarse entre el tubo de cátodo y el gusano anestesiado, lo más cerca posible del gusano como sea posible. El blindaje del cable debe ser diseñado, fabricado y colocado de modo que protege el tejido deseado, pero expone completamente el resto del gusano. Muchos fabricantes comerciales va a producir escudos personalizados de plomo de su diagrama de diseño simple, hemos utilizado con éxito Alpha Systems Corp. (Bluffdale, UT). El plomo debe ser suficientemente gruesa para permitir la cantidad deseada de blindaje. Por ejemplo, si casi completa de un blindaje 320 kV haz de rayos X se desea, el plomo debe ser de 4,5 a 6 mm de espesor. La planaria y el escudo se colocan enun Holtfreter de papel de filtro empapado en fila placa de Petri que descansa en un cubo de hielo. Dado un número suficientemente amplio campo de rayos X de radiación y una serie de protectores de plomo idénticas, muchos ejemplares pueden ser parcialmente irradiado a la vez (no se muestra).

Figura 2. La construcción de la cámara de recuperación. (A) una vista en despiece de la cámara de tejido recuperación del trasplante, mostrando todos los componentes que están en capas sobre una encima de otra después de ser empapado en caseína saturado Holtfreter de solución. (B) Una cámara de recuperación casi terminado, que ilustra la colocación de enclavamiento de la Whatman # 3 rectángulos de papel de filtro que encierra el ajustadamente planaria anestesiados, impidiendo el movimiento durante la curación. La construcción cuidadosa de la cámara de recuperación evita el movimiento de los animales y la desecación, la promoción de una curación rápida y una mayor eficacia del trasplante de tejido.

Figura 3. Resultados representativos de sencilla irradiación parcial posterior. Como Dubois descritas ^7, (A) cuando la mitad posterior de las planarias estaban protegidos con plomo y luego expuestos a irradiación con rayos X del tejido anterior se observó que regresar de nuevo a la frontera entre los irradiados y blindado tejido de punto en el que blastemas no pigmentadas formado y los animales comenzaron a regenerar. (B) Por otro lado, cuando los animales fueron decapitados después de la irradiación mismo parcial realizada en (A), la regresión del tejido no se observó y el restante tejido anterior irradiado fue rescatado. El decapitado animales parcialmente irradiadas cabezas regenerada (B), sin embargo, la regeneración se retrasó considerablemente en comparación con los no irradiados controles decapitados (C).

Figura 4. Representante outcome de la ablación parcial de células madre después de la irradiación parcial. todo el montaje hibridación in situ (WISH) para el marcador de células madre Smed-piwi-1 revela que planaria tipo salvaje células madre han distribuido a lo largo de sus cuerpos, con la excepción de que el tejido anterior al fotorreceptores (punta de flecha) y la faringe adecuada ¹⁴ (asterisco). (A) Deseo de Smed-piwi-1 en el control irradiado, pero totalmente protegidos planaria fijado tres días después de la irradiación muestra una distribución de células madre que es indistinguible de la de la planaria de tipo salvaje. (B) Por otro lado, deseo de Smed-piwi-1 en los animales que fueron sólo parcialmente protegidos, dejando a la exposición anterior y posterior, pero también se han fijado tres días después de la irradiación muestra que las células madre se realiza la ablación de las regiones no blindados . Las barras de escala son 500 micras.

Figura 5. Examples de trasplante de tejidos con y sin éxito. (A) Imágenes en directo de puntos de vista dorsal y ventral de una planaria trasplantado con éxito tres días después del trasplante. El injerto (indicado) es claramente visible en ambas caras dorsal y ventral, y está rodeada por tejido sin pigmentación característica en la interfaz de injerto-huésped. (B) En consecuencia, los trasplantes fallidos de no mostrar ningún injerto de tejido visible en el sitio del trasplante (indicado) y en lugar de mostrar un curado, la herida no pigmentado, lateral desde el trasplante fracasó. Un injerto que se adhiere a sólo el dorsal o la superficie ventral puede parecerse a un trasplante con éxito (A) cuando se ve desde un lado y un trasplante de éxito (B) cuando se ve desde el otro. (C) Cuando el tipo salvaje (wt) el tejido se injerta en un huésped irradiado que ha sido extirpada de las células madre residentes y las células madre trasplantadas se reveló más tarde por el deseo de Smed-piwi-1 dos días después del trasplante,el éxito del trasplante se muestra claramente por la presencia específica de las células madre sólo en o alrededor de la ubicación del injerto (puntas de flecha). Las barras de escala son 500 micras.

Discusión

Importancia de la inmovilización

La inmovilización es, con mucho, el paso más crítico para la correcta realización de cualquiera de estos procesos. Si planaria no están bien inmovilizados antes de la irradiación parcial, que puede moverse por debajo de la placa de plomo, produciendo resultados inconsistentes y confusión. Además, si los animales no están lo suficientemente inmovilizada después del trasplante, el gusano anfitrión probable se alejará del tejido del injerto, lo que resulta en un fr...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
De uso general con una pipeta de transferencia	Samco	691
Los tubos capilares (ID 0,75 mm)	FHC	30-30-0
Tubos capilares (OD 0,7 mm)	FHC	30-50-08
Parafilm M	VWR	52858-076
Kimwipes 34155	VWR	500029-891
Papel de filtro negro	Schleicher y Schuell	10310809
Whatman # 2 filtro de papel 1002-055	Fisher Scientific	09-810B
Whatman # 3 filtro de papel 1003-185	Fisher Scientific	09-820E
Rollos de papel de cigarrillos	Zig-Zag, original	NA
Petriplatos	VWR	82050-544
Pinzas DUMONT, INOX # 5	FST	11251-20
Cloretona	Sigma Aldrich	112054
Caseína	Sigma Aldrich	C3400
Escudos de plomo	Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT	Diseño personalizado
XRAD-320 Irradiador Biológica	La precisión de rayos X, North Branford, CT	NA