El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

Resumen

Una técnica para identificar sitios traduccionales pausa en ARNm se describe. Este procedimiento se basa en el aislamiento de polipéptidos nacientes acumulan en los ribosomas durante la traducción in vitro de un ARNm diana, seguido por el análisis del tamaño de las cadenas nacientes utilizando una electroforesis en gel de desnaturalización.

Resumen

La tasa de alargamiento de traslación no es uniforme. mRNA estructura secundaria, el uso de codones y ARNm proteínas asociadas pueden alterar el movimiento del ribosoma en el mensaje ^{para una revisión ver 1.} Sin embargo, ahora se acepta ampliamente que el uso de codones sinónimos es la principal causa de la falta de uniformidad tasa de elongación de traducción ^1. Codones sinónimos no se utilizan con frecuencia idéntica. Un sesgo existe en el uso de codones sinónimos con algunos codones utilizados con mayor frecuencia que los otros ^2. Codón sesgo es organismo, así como tejido específico ^2,3. Además, la frecuencia de uso del codón es directamente proporcional a las concentraciones de cognado ARNt ^4. Así, un codón de frecuencia utilizado tendrá mayor multitud de ARNt correspondientes, que implica, además, que un codón frecuente se traducirá más rápido que un infrecuente una. Así, las regiones en ARNm enriquecido en los codones raros (sitios potenciales de pausa), por regla general más lento movimiento ribosoma en la MessaGE y causa la acumulación de péptidos nacientes de los respectivos tamaños ^5-8. Estos sitios de pausa puede tener un impacto funcional en la expresión de la proteína, la estabilidad del mRNA y plegamiento de proteínas ^{para una revisión véase 9.} De hecho, se ha demostrado que el alivio de los sitios de pausa tales puede alterar movimiento ribosoma del ARNm y, posteriormente, puede afectar a la eficiencia de la co-traduccional plegamiento de proteínas (in vivo) ^1,7,10,11. Para comprender el proceso de plegamiento de proteínas in vivo, en la célula, que finalmente se acopla con el proceso de síntesis de proteínas es esencial para obtener información integrales en el impacto de uso del codón / ARNt contenido en el movimiento de los ribosomas a lo largo de ARNm durante la elongación traslacional .

Aquí se describe una técnica simple que se puede utilizar para localizar los sitios principales de pausa de traducción para un ARNm dado traducido en diversos sistemas libres de células ^{de 6-8.} Este procedimiento se basa en el aislamiento de la naciente accumulati polipéptidosng en ribosomas durante la traducción in vitro de un ARNm diana. La razón es que en los codones de baja frecuencia, el aumento en el tiempo de residencia de los resultados ribosomas en mayores cantidades de péptidos nacientes de las dimensiones correspondientes. En ARNm transcrito in vitro se utiliza para in vitro reacciones de traducción en la presencia de aminoácidos marcados radiactivamente para permitir la detección de las cadenas nacientes. Con el fin de aislar ribosoma enlazados complejos polipeptídicas nacientes la reacción de traducción se coloca sobre la parte superior de solución de glicerol 30%, seguido por centrifugación. Polipéptidos nacientes en polysomal pellet se trata adicionalmente con ribonucleasa A y se resolvieron por SDS-PAGE. Esta técnica puede ser potencialmente utilizado para cualquier proteína y permite el análisis de movimiento a lo largo de ARNm al ribosoma y la detección de los sitios de pausa principales. Además, este protocolo puede ser adaptado para estudiar los factores y condiciones que pueden alterar el movimiento del ribosoma y, por tanto, potencialmente, también pueden alterar ºfunción e / conformación de la proteína.

Protocolo

1. Preparación del ADN de plantilla y la transcripción in vitro

1. El gen de interés se clona bajo T7 y / o, por ejemplo SP6 promotor transcripcional.
2. Para la transcripción in vitro del ADN molde se linealizó con una enzima de restricción apropiada de corte aguas abajo del codón de parada ORF y / o ARNm extremo 3 '. Uno tiene que verificar linealización completa del ADN de plásmido mediante la ejecución del producto de digestión de restricción en la electroforesis en gel de agarosa.
3. El plásmido linealizado se utiliza en la reacción de transcripción in vitro. Diferentes concentraciones de ADN molde se puede analizar para determinar las concentraciones de ADN óptima requerida para la transcripción in vitro. Por lo general, con el kit de alta Megascript Ambion de transcripción rendimiento (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY), 1 mg de ADN linearizado da 40-60 g de ARNm. En la transcripción in vitro se realiza siguiendo las instrucciones del fabricante (Ambion / Life Technologies, Grand Island, NY).
4. Tras la transcripción in vitro del mRNA se purificó por precipitación de cloruro de litio de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Megascript Kit de alta Ambion de transcripción de rendimiento).
5. integridad ARNm se ve verificada por electroforesis en geles de acrilamida o agarosa.

2. Celular in vitro traducción libre

Para la traducción in vitro usando R abbit R eticulocyte lisado, RRL (Promega, Madison, WI), siga los siguientes pasos:

1. Preparar 100 l en la enseñanza de traducción in vitro de reacción fabricante siguiente. En pocas palabras, en agua libre de nucleasa añadir 2 l mezcla de aminoácidos menos metionina (1 mM), 10 unidades de inhibidor de RNasa (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), 20 Ci de los desechos radiactivos [S ^{35]-metionina} (MP Biomedicals, Solon, OH), 70 l de lisado de reticulocitos de conejo (Promega, Madison, WI).
2. Incubar ºe reacción a 30 ° C durante 5 minutos para pre caliente la reacción de traducción. Añadir 2 g de ARNm para la reacción de traducción y se incuba a 30 ° C durante 5 min.
3. Se detiene la reacción mediante la colocación de la reacción de traducción en hielo.

3. El aislamiento de polipéptidos nacientes de reacción de traducción in vitro

1. Para aislar polipéptido naciente obligado a ribosomas (polisomas), la reacción de traducción se coloca sobre la parte superior de 4,5 ml de 30% de glicerol en 10 mM, pH tampón Tris-HCl 7,6, que contenía 100 mM de KCl, 10 mM de MgCI _2, y se centrifugó a 100.000 xg en un TLA-110 del rotor (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA) durante 1 hora a 4 ° C.
2. El sobrenadante se retira cuidadosamente adicional.
3. El polysomal pastilla que contiene polipéptidos nacientes se resuspende en un volumen pequeño (10-15 l) de 1 mM, pH tampón Tris-HCl 7,6, que contiene 0,5 mg / ml de ribonucleasa A, (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY) y se incubaron durante 30 min a 37 ° C. En ordenpara mejorar la hidrólisis del enlace éster peptidil-ARNt, se añade NaOH a una concentración final de 10 mM, y la incubación se continúa durante 30 minutos adicionales.

In vitro reacción de traducción del mRNA y montado sin realizó bajo las mismas condiciones (seguido por aislamiento de los péptidos nacientes como se ha descrito) serviría como un mayor control. El tratamiento de la reacción de traducción (s) con puromicina antes de someter el extracto a centrifugación en gradiente de densidad puede servir como un control adicional.

4. La solución del polipéptido naciente en Tris-tricina SDS-PAGE

1. Los polipéptidos nacientes aislados se resuelven y se analizaron en Tris-tricina SDS-PAGE. Tenga en cuenta que la cantidad del material cargado en el gel depende de la eficiencia de etiquetado proteína, la eficiencia en la traducción de proteínas y muchos otros parámetros. La cantidad de material cargado debe ajustarse empíricamente para permitir que los BESt visualización y la separación de cadenas de polipéptidos individuales nacientes.
2. Después de geles de electroforesis se fijan, se secó al vacío utilizando gel de tintorero y se sometió a autorradiografía. La distribución de los polipéptidos nacientes se observan utilizando phosphoimaging.

5. Los resultados representativos

Bovina gamma-B Cristalina se tradujo en lisado de reticulocitos de conejo, así como en E. E. S30 Sistemas Extracto (Promega, Madison, WI), seguido por aislamiento de nacientes cadenas polipeptídicas. La Figura 1 muestra los pasos implicados en el aislamiento de ribosoma cadenas nacientes consolidados. En el presente estudio el objetivo fue poner a prueba, si se cambia el entorno del repertorio de la traducción, es decir de los tRNAs (conocido por ser sustancialmente diferentes de los mamíferos (RRL) y los sistemas procariotas (E. coli) debido a las diferencias en el codón sesgo entre los organismos) puede alterar movimiento ribosoma a lo largo de ARNm y efectuar la distribución de los sitios de pausa de traducción.Movimiento ribosoma alterada debería conducir a cambios en la distribución de tamaños de polipéptidos nacientes acumulan durante la traducción, así como sus intensidades relativas. Intensidades relativas de las bandas de la duración de la pausa. Los polipéptidos nacientes se aislaron y se resolvieron en 16,5% T, 6% de C Tris-tricina SDS-PAGE (Figura 2). Gamma-B Cristalina es una proteína de 20 kDa. La observación de polipéptidos nacientes de no idénticos longitudes e intensidades en RRL y E. sistemas coli indica que el movimiento de los ribosomas a lo largo de ARNm en estos dos sistemas sigue una cinética diferentes de traducción. Por ejemplo, se observó un destacado grupo de 17,7 kDa en E. E. lisado y no en el sistema de RRL, que sugiere que hay un sitio adicional pausa traslacional en la región extremo 3 'del ARNm (codificación región C-terminal de Gamma B Cristalina), cuando se traduce en E. E. del sistema. Tomamos nota de que la gamma-B puertos Cristalina tándem codones Arg (AGG ₁53 y ₁₅₄ AGA) que son frecuentes en sistemas de mamíferos, pero se sabe que son extremadamente raros y traducido lentamente en E. coli. un nuevo péptido naciente acumulando en E. sistema de E. coli (~ 17,7 kDa Figura 2.2) es causado probablemente por una pausa en los ribosomas estos codones raros en tándem. Nótese que las bandas no se puede observar en la ausencia de ARNm (Figura 2,3) y que el tratamiento puromicina elimina la mayor parte de las cadenas nacientes de polisomas (Figura 2.3). El tratamiento prolongado con puromicina (> 15 min) elimina todas las cadenas nacientes (datos no presentados). Esto confirma que los productos polipeptídicos observadas son las cadenas de ribosomas asociados nacientes, en lugar de mRNPs cosedimenting con polisomas.

Como se mencionó anteriormente, el sesgo codón es organismo, así como tejidos específicos. El ejemplo representativo se describe aquí, indica claramente que cambiar el entorno del repertorio de la traducción, es decir de tRNAs / codónsesgo puede conducir a alteraciones del movimiento del ribosoma a lo largo del ARNm. Evidentemente, esta sencilla técnica no sólo puede permitir la identificación de los sitios de pausa de traslación a lo largo de ARNm, sino que también permite una rápida comparación de los sitios de traducción de pausa entre los diferentes sistemas.

Figura 1. Esquema explicar los pasos implicados en el aislamiento de ribosoma polipéptidos nacientes consolidados. Bovina gamma-B Cristalina secuencia ORF (528 pares de bases) fue clonado aguas abajo del promotor T7 en pBSKS +. Para la transcripción in vitro del ADN molde se linealizó por tratamiento con EcoRI. Plantilla linealizado fue utilizado para la transcripción in vitro. Promotor T7 en molde de ADN es reconocida por la RNA polimerasa T7 que transcribe el aguas abajo gamma-B gen Cristalina. ARNm se purifica usando cloruro de litio método de precipitación. El mRNA purificado se utiliza para la traducción in vitro. Siguienteincubación, la reacción de traducción se coloca sobre la parte superior de solución de glicerol al 30% y se centrifuga durante 1 hora a 4 ° C a 100.000 xg para aislar ribosoma polipéptidos nacientes consolidados.

Figura 2. El aislamiento de la especie bovina B gamma-cristalinas nacientes polipéptidos traducidos en lisado de reticulocitos de conejo (RRL) y E. Lisado coli. 2 ARNm g se mezcló en 100 l de reacción que contiene RRL o E. E. S30 Extracto System (Promega, Madison, WI) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con 20 Ci ^[35 S]-metionina y se incubaron a 30 ° C durante 5 min. Después de la incubación de la reacción de traducción se estratificó en la parte superior de 4,5 ml de 30% de glicerol en 10 mM, pH tampón Tris-HCl 7,6, que contenía 100 mM de KCl, 10 mM de MgCI _2, y se centrifuga durante 1 hora a 4 ° C y 100.000 g X en un rotor TLA-110 (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA). El aislado precipitado polyribosome fue resuspended en 20 l de 1 mM de Tris-HCl pH 7,6, que contiene 0,5 mg / ml de ribonucleasa A (Invitrogen / Life Technologies, Grand Island, NY), seguido por tratamiento con NaOH (como se describe en la sección de protocolo). Polipéptidos nacientes se resolvieron en 16,5% T, 6% de C Tris-Tricina gel de SDS PAGE. El gel se seca y se expone a autorradiografía. Tras la exposición, el gel se escanea con escáner de imágenes Typhoon de GE Healthcare. La figura 2.1 muestra el gel con polipéptidos nacientes aislado y resuelto después de las reacciones de traducción realizado en dos sistemas diferentes (RRL y E. coli). Figura 2.2 El gel fue analizado por Image Quant TL ., software v2005 y se utiliza aquí como un ejemplo para mostrar que el peso molecular y la intensidad de los polipéptidos nacientes que se acumulan en dos sistemas pueden ser fácilmente analizado y comparado la figura 2.3 se muestran dos tipos de controles: polipéptidos nacientes aislados y se resolvieron en SDS-PAGE después de la traducción Las reacciones fueron ensambladassin ARNm y / o después de las reacciones de traducción fueron tratados con puromicina (5 min, concentración final. 1 mM) antes de la reacción se sometió a centrifugación.

Discusión

Para obtener resultados reproducibles, la calidad y la concentración de los componentes utilizados para la transcripción in vitro y reacciones de traducción son críticos. En el presente estudio hemos utilizado los kits disponibles comercialmente y los extractos que proporcionan datos altamente reproducibles, si se maneja con cuidado. Sin embargo, competentes traducción-extractos pueden prepararse a partir de la celda de su elección, si es necesario. Calidad de ARNm pueden afectar a la traducción, por l...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo / Kit	Empresa	Número de catálogo
Megascript T7 Kit de Transcripción de alta rentabilidad	Ambion	AM1333
Inhibidor de ribonucleasa	Invitrogen	15518012
Trans [35 S]-Label	MP Biomedicals	0151006
Ribonucleasa-A	Invitrogen	12091
Sistema de lisado de reticulocitos de conejo, nucleasa tratada	Promega	L4960
E. coli S30 Extracto del Sistema de las plantillas lineales	Promega	L1030
Centrifugación	Beckman Coulter	Optima TLX Ultracentrífuga
De almacenamiento de fósforo autorradiografíay	GE Healthcare	El tifón 9410 Imager modo variable
Software para análisis polipéptido naciente	GE Healthcare	Image Quant TL, v2005