El aislamiento de los ribosomas polipéptidos nacientes Bound<em&gt; In vitro</em&gt; Para la identificación de sitios de traslación pausa a lo largo del ARNm

Resumen

Una técnica para identificar sitios traduccionales pausa en ARNm se describe. Este procedimiento se basa en el aislamiento de polipéptidos nacientes acumulan en los ribosomas durante la traducción in vitro de un ARNm diana, seguido por el análisis del tamaño de las cadenas nacientes utilizando una electroforesis en gel de desnaturalización.

Resumen

La tasa de alargamiento de traslación no es uniforme. mRNA estructura secundaria, el uso de codones y ARNm proteínas asociadas pueden alterar el movimiento del ribosoma en el mensaje ^{para una revisión ver 1.} Sin embargo, ahora se acepta ampliamente que el uso de codones sinónimos es la principal causa de la falta de uniformidad tasa de elongación de traducción ^1. Codones sinónimos no se utilizan con frecuencia idéntica. Un sesgo existe en el uso de codones sinónimos con algunos codones utilizados con mayor frecuencia que los otros ^2. Codón sesgo es organismo, así como tejido específico ^2,3. Además, la frecuencia de uso del codón es directamente proporcional a las concentraciones de cognado ARNt ^4. Así, un codón de frecuencia utilizado tendrá mayor multitud de ARNt correspondientes, que implica, además, que un codón frecuente se traducirá más rápido que un infrecuente una. Así, las regiones en ARNm enriquecido en los codones raros (sitios potenciales de pausa), por regla general más lento movimiento ribosoma en la MessaGE y causa la acumulación de péptidos nacientes de los respectivos tamaños ^5-8. Estos sitios de pausa puede tener un impacto funcional en la expresión de la proteína, la estabilidad del mRNA y plegamiento de proteínas ^{para una revisión véase 9.} De hecho, se ha demostrado que el alivio de los sitios de pausa tales puede alterar movimiento ribosoma del ARNm y, posteriormente, puede afectar a la eficiencia de la co-traduccional plegamiento de proteínas (in vivo) ^1,7,10,11. Para comprender el proceso de plegamiento de proteínas in vivo, en la célula, que finalmente se acopla con el proceso de síntesis de proteínas es esencial para obtener información integrales en el impacto de uso del codón / ARNt contenido en el movimiento de los ribosomas a lo largo de ARNm durante la elongación traslacional .

Aquí se describe una técnica simple que se puede utilizar para localizar los sitios principales de pausa de traducción para un ARNm dado traducido en diversos sistemas libres de células ^{de 6-8.} Este procedimiento se basa en el aislamiento de la naciente accumulati polipéptidosng en ribosomas durante la traducción in vitro de un ARNm diana. La razón es que en los codones de baja frecuencia, el aumento en el tiempo de residencia de los resultados ribosomas en mayores cantidades de péptidos nacientes de las dimensiones correspondientes. En ARNm transcrito in vitro se utiliza para in vitro reacciones de traducción en la presencia de aminoácidos marcados radiactivamente para permitir la detección de las cadenas nacientes. Con el fin de aislar ribosoma enlazados complejos polipeptídicas nacientes la reacción de traducción se coloca sobre la parte superior de solución de glicerol 30%, seguido por centrifugación. Polipéptidos nacientes en polysomal pellet se trata adicionalmente con ribonucleasa A y se resolvieron por SDS-PAGE. Esta técnica puede ser potencialmente utilizado para cualquier proteína y permite el análisis de movimiento a lo largo de ARNm al ribosoma y la detección de los sitios de pausa principales. Además, este protocolo puede ser adaptado para estudiar los factores y condiciones que pueden alterar el movimiento del ribosoma y, por tanto, potencialmente, también pueden alterar ºfunción e / conformación de la proteína.

Protocolo

1. Preparación del ADN de plantilla y la transcripción in vitro

1. El gen de interés se clona bajo T7 y / o, por ejemplo SP6 promotor transcripcional.
2. Para la transcripción in vitro del ADN molde se linealizó con una enzima de restricción apropiada de corte aguas abajo del codón de parada ORF y / o ARNm extremo 3 '. Uno tiene que verificar linealización completa del ADN de plásmido mediante la ejecución del producto de digestión de restricción en la electroforesis en gel de agarosa.
3. El plásmido linealizado se utiliza en la reacción de transcripción in vitro. Diferentes concentracion....

Discusión

Para obtener resultados reproducibles, la calidad y la concentración de los componentes utilizados para la transcripción in vitro y reacciones de traducción son críticos. En el presente estudio hemos utilizado los kits disponibles comercialmente y los extractos que proporcionan datos altamente reproducibles, si se maneja con cuidado. Sin embargo, competentes traducción-extractos pueden prepararse a partir de la celda de su elección, si es necesario. Calidad de ARNm pueden afectar a la traducción, por l.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo / Kit	Empresa	Número de catálogo
Megascript T7 Kit de Transcripción de alta rentabilidad	Ambion	AM1333
Inhibidor de ribonucleasa	Invitrogen	15518012
Trans [35 S]-Label	MP Biomedicals	0151006
Ribonucleasa-A	Invitrogen	12091
Sistema de lisado de reticulocitos de conejo, nucleasa tratada	Promega	L4960
E. coli S30 Extracto del Sistema de las plantillas lineales	Promega	L1030
Centrifugación	Beckman Coulter	Optima TLX Ultracentrífuga
De almacenamiento de fósforo autorradiografíay	GE Healthcare	El tifón 9410 Imager modo variable
Software para análisis polipéptido naciente	GE Healthcare	Image Quant TL, v2005