Artículo de método

Un modelo humano las trompas de Falopio para la Investigación de

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DOI:

10.3791/4036

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11 de agosto de 2012

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Microbiology and Hygiene, University of Lübeck, 2Institute of Anatomie, University of Lübeck, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck, 4Medical Clinic III, University Hospital of Schleswig-Holstein, University of Lübeck

En este artículo

Resumen

Se describe un Ex vivo infección Modelo para la visualización de las interacciones directas de los patógenos bacterianos con células humanas de la trompa de Falopio. El modelo de todo el tejido del órgano se creó para investigar C. trachomatis La patología inducida por la trompa de Falopio en las mujeres "como" condiciones de vida.

Resumen

Infecciones del tracto genital por Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) son las más frecuentes enfermedades de transmisión sexual en las mujeres de todo el mundo. Aclaramiento de ineficaz o la persistencia de los patógenos puede dar lugar a infecciones ascendentes del tracto genital superior y se supone para causar daño inflamatorio crónico de 1,2 tejidos infectados. Como consecuencia, graves secuelas clínicas como la enfermedad inflamatoria pélvica (EIP), oclusión de las trompas e infertilidad puede ocurrir 3,4.

La mayor parte de la investigación con C. trachomatis se ha realizado en líneas de células epiteliales (por ejemplo, células HEp-2 y HeLa 229-) o en ratones. Sin embargo, como con modelos de cultivo a base de células, que no reflejan ni la fisiología del tejido nativo ni la fisiopatología de C. trachomatis del tracto genital en vivo 5. Otras limitaciones están dadas por el hecho de que centrales cascadas de señalización (por ejemplo, el IFN-γ MEDIATed JAK / STAT vía de señalización) que controlan el crecimiento intracelular Chlamydia difieren fundamentalmente entre los ratones y los seres humanos 6,7. Nosotros y otros por lo tanto, estableció un modelo de órgano en su totalidad las trompas de Falopio para investigar las interacciones directas entre C. trachomatis y las trompas de Falopio humana ex vivo las células 8,9.

Para este propósito, las trompas de Falopio humanos de las mujeres sometidas a histerectomía se recogieron y se infectan con C. trachomatis serovar D. Dentro de las 24 h después de la infección, la muestra donde se analizaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) para detectar la Chlamydia trachomatis mediado daño epitelial, así como C. trachomatis formación inclusión en el tejido de Falopio.

Protocolo

1. Preparación de Chlamydia trachomatis serovar D de archivo

  1. Infect confluente 175 cm 2 frasco de cultivo celular que contiene células HeLa-229 con 4 ml C. trachomatis D en el SPG de amortiguamiento.
  2. Incubar durante una hora a 37 ° C durante agitación constante.
  3. Añadir 20 ml de DMEM con 10% de FCS y 240 l cicloheximida.
  4. Incubar en una incubadora humidificada durante 48 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
  5. Añadir 5 ml de perlas de vidrio estériles y agitar fuerte para separar y destruir a C. trachomatis albergar HeLa-229 células.
  6. Recoger el sobrenadante y añadir otros 5 ml de perlas de vidrio estériles.
  7. Roca tres veces durante 1 min para destruir todas las células HeLa-229 y suelte C. trachomatis.
  8. Centrifugar durante 5 min a 1000 RPMI y 4 ° C para deshacerse de los desechos celulares.
  9. Recoger el sobrenadante para la infección de 8 a 10 175 cm cultivo celular 2 matraces g confluenteRowN con HeLa 229 células.
  10. Incubar cada matraz con 4 ml de tampón SPG y 4 ml de sobrenadante de la infección anterior durante una hora a 37 ° C con agitación constante.
  11. Después de una hora añadir 15 ml de DMEM con 10% de FCS y 230 l cicloheximida seguido de 48 h de incubación a 37 ° C y 5% de CO 2.
  12. Añadir 5 ml de perlas de vidrio estériles, agitar para separar y destruir a C. trachomatis albergar HeLa-229 células.
  13. Recoger el sobrenadante y añadir otros 5 ml de perlas de vidrio estériles.
  14. Roca tres veces durante 1 min para destruir todas las células HeLa-229 y suelte C. trachomatis.
  15. Centrifugar durante 5 min a 1000 RPMI a 4 ° C para deshacerse de los desechos celulares.
  16. Recoger el sobrenadante.
  17. Llena 40 ml de sobrenadante en tubos Falcon de 50 ml y centrifugar durante 99 minutos con 11.000 RPMI.
  18. Después de la centrifugación descartar el sobrenadante y lavar el precipitado con 1 ml de tampón SPG.
  19. Homogeneizar elpellet en 1 ml y SPG l alícuota de 20 en un 1, 5 ml tubo Eppendorf, almacenar a -70 ° C hasta su uso. La actividad biológica de la población preparada se confirmó en una establecida HeLa-229 modelo de infección celular.

2. Preparación de las trompas de Falopio Humanos

  1. Tienda de trompas de Falopio humanas (HFT) de las mujeres sometidas a histerectomía inmediatamente después de la cirugía en RPMI que contiene 5% de FCS sin antibióticos en la 4 ° C hasta la preparación. El protocolo fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Lübeck (09-153). Las mujeres incluidas en el estudio (edad 34 hasta 53) no tenían antecedentes de antes de C. trachomatis infección. Tejido de las trompas de Falopio se recogió en la esterilización periparto previa solicitud materna durante la cesárea o durante una histerectomía debido a fibromas uterinos sintomáticos en la fase lútea. Todos se pusieron a prueba HFT negativos para C. trachomatis por PCR.
  2. Diseccionar el HFT en una placa de Petri que contiene RPMI con5% de FCS sin antibióticos. Durante el procesamiento de todo el tejido debe ser sumergido en un medio para prevenir el secado.
  3. Corte y deseche el tejido conjuntivo y tejido destruido durante la cirugía.
  4. Después de la disección abrir el HFT cuidadosamente con un pequeño bisturí.
  5. Para más experimentos preparar piezas de tejido en el tamaño de 0,5 cm x 0,5 cm hasta 1 cm x 1 cm.
  6. Para el modelo HFT infección almacén en 1 ml de RPMI que contiene 5% de FCS sin antibióticos. Las muestras fueron infectadas con el HFT 5.5x10 5 IFU (unidades formadoras de inclusión) de C. trachomatis.
  7. Incubar espécimen HFT en 37 ° C, 5% de CO 2 y el 21% de O 2, así como en 37 ° C, 5% de CO 2 y 2% de O 2 durante 24 h.
  8. Después de recolectar la muestra el tiempo de incubación y la tienda en fijador Monti por lo menos tres días a 4 ° C hasta su SEM / TEM preparación.

3. Preparación de la pieza HFT para TEM

  1. ParaTEM quitar muestra de fijador de Monti y corte de 2 x 2 mm a 4 x trozos de 5 mm. El tejido restante se puede utilizar para SEM.
  2. Lavar las piezas con tampón de cacodilato de sodio, pH 7,35 durante 1 h.
  3. Incubar en 1% (w / v) de tetróxido de osmio en agua destilada. durante la noche.
  4. Eliminar el exceso de tetróxido de osmio por lavado min 6x5 en tampón de cacodilato de sodio, pH 7,35.
  5. Eliminar el agua mediante la incubación en concentraciones crecientes de etanol en agua (v / v) (30% durante 2 h, 40% durante 2 h, 50% durante 2 h, 60% durante 2 h, 70% durante la noche, el 80% de 2 h, 90% durante 1 h, 95% durante 1 h, 100% durante 1 h.
  6. Lavar etanol para 2 x 15 min en óxido de propileno y, posteriormente, transferir a una mezcla de 50% (v / v) Araldite recién preparada (incluyendo todos los componentes) en propileno y se incuba durante la noche.
  7. Transferir a Araldite recién preparada (incluyendo todos los componentes) durante al menos 1 hora.
  8. Traslado a la incrustación de moldes planos y se llenan de Araldite.
  9. Vamos a endurecer durante aralditepor lo menos 48 horas a 60 ° C
  10. Tras el recorte de la muestra integrada corte semi-secciones delgadas (700 nm) en un ultramicrotomo utilizar cuchillos de vidrio o un cuchillo de diamante histo y se tiñen con tinción de Richardson.
  11. Corte secciones ultrafinas (aprox. 70 nm), utilizando un cuchillo de diamante y la transferencia a las redes de cobre (por ejemplo, 150 mallas cuadradas).
  12. Mancha de ultra-delgadas secciones con acetato de uranilo 0,5% (w / v) en agua destilada. seguido por 3% (w / v) de citrato de plomo en agua destilada. en un teñidor sección automática. Alternativamente, las secciones se pueden teñir manualmente dejando rejillas 15 minutos en una solución saturada de acetato de uranilo centrifugada en agua destilada. seguido por citrato de plomo 0,3% (w / v) en agua destilada.

4. Preparación de la muestra HFT para SEM

  1. Para eliminar el SEM muestra de fijador de Monti, oriente con el epitelio hacia arriba en una hoja de 1,5 x 1 cm de corcho y de fijar la posición con agujas de insectos.
  2. Transferir la muestra en el corcho a las cestas de metal adecuados ylavar durante 30 minutos en tampón de cacodilato de sodio, pH 7,35.
  3. Eliminar el agua mediante la incubación de la muestra en la creciente concentración de las mezclas de acetona / agua (v / v) 30% durante 6 h, 40% durante 6 h, 60% durante 8 h, 70% durante la noche, el 80% durante 2 h, 90% para 2 horas y 100% durante la noche (ser extremadamente cuidadoso para mantener la muestra continuamente sumergido).
  4. Transferir a la acetona fresca 100% y la muestra seca mediante secado por punto crítico (temperatura 40 ° C, presión 80 bar).
  5. Eliminar las agujas, de corcho y de muestras de pegamento con el epitelio hacia arriba en el monte de la muestra SEM equipado con una ficha de carbón conductor con un cemento de carbono conductor. Utilice conductora de plata líquida para mejorar la conductividad entre el monte y la ficha de carbono conductor.
  6. Preparar un recubrimiento conductor de platino, oro o paladio de la muestra utilizando un recubridor de pulverización catódica.

5. La tinción de Semi Secciones finas con manchas de Richardson

  1. Que semi seco en secciones delgadas de diapositivas.
  2. Mancha de secciones con la solución de tinción a 60 ° C durante 1-2 min.
  3. Lavar con agua destilada.
  4. Secciones secas y cubreobjetos.

6. Los resultados representativos

Dentro del modelo de Falopio humana infección tubo hemos sido capaces de visualizar las diferencias en la morfología epitelial entre los controles no infectados (Figura 1) y la C. trachomatis - tubos infectados (Figura 2) bajo condiciones normoxic. Características morfológicas diferencias implícitos patógenos inducida por la inflamación y la lisis de las células epiteliales del tubo de Falopio que no podían ser detectadas en los controles no infectados. Uso semi secciones delgadas y microscopía electrónica de transmisión que fueron capaces de demostrar intracelular C. formación trachomatis inclusión en la ex vivo tejido humano infectado trompa de Falopio (Figura 3, 5), pero no en los controles no infectados (Figura 4). Como las concentraciones de oxígenociones en el tracto genital de la mujer ya son bajos en condiciones fisiológicas 11, y una disminución aún más durante un proceso inflamatorio que también investigó el modelo bajo condiciones hipóxicas. Los resultados preliminares indican que el modelo es útil para analizar el crecimiento de clamidia y descendientes en las diferentes concentraciones de oxígeno. Chlamydia inducida por el daño de las células epiteliales tiene que ser separado de los artefactos que están mediadas a través de la preparación y la manipulación imprudente de las trompas de Falopio antes de la infección (Figura 6).

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Figura 1. Microscopía electrónica de barrido (SEM) de una de Falopio humana no infectados después de la incubación de un día en medio de control (flecha verde muestran células ciliadas flecha azul muestra de células no ciliadas).

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Figura 2. Electrónica de barrido micros copia (SEM) de una ex vivo trachomatis C infecta el tubo de Falopio humana un día después de la infección (flecha blanca marca de ruptura de la inclusión).

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Figura 3. Secciones delgadas semi muestran típicas inclusiones intracelulares (flechas blancas) 1d después de la infección de las trompas de Falopio humana con C. trachomatis ex vivo.

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Figura 4. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) de un no-humano infectado tubo de Falopio días después de la incubación en un medio de control.

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Figura 5. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) de un C. ex vivo trachomatis infecta el tubo de Falopio humana un día después de la infección (flechas blancas marcan las inclusiones clamidias).

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Figura 6. Microscopía electrónica de barrido (SEM) de las trompas de Falopio epitelio dañado mediante la preparación y manipulación imprudente de espécimen (blanco flechas marca destruido tejido epitelial).

Discusión

Visualización de patógenos inducida por el daño al tejido infectado es arduo y, a menudo limitada a los procedimientos experimentales en ratones. Hemos establecido un modelo in vivo en humanos la infección ex trompas de Falopio para analizar C. trachomatis de la parte superior del tracto genital femenino. Mediante el uso de este método, hemos sido capaces de visualizar C. trachomatis - inducida por los daños al epitelio de las trompas de Falopio humana dentro de un día después de la infección. Inflamación celular y la lisis eran típicos los cambios morfológicos que se observaron en C. trachomatis - infectados trompas de Falopio, pero no en los controles no infectados. TEM análisis reveló que las clamidias poner en práctica un típico ciclo de desarrollo intracelular en los tejidos infectados, que muestra grandes inclusiones con la re-diferenciados cuerpos elementales, sino también pequeñas inclusiones con cuerpos reticulados agrandados que pudieran indicar la persistencia. Sin embargo, la imagen morfológica por sí sola no es suficiente para discriminar entre REPLinfecciones icating y persistente, que se caracterizan por una disminución del metabolismo y aumento de la resistencia a los antimicrobianos 10.

La destrucción del epitelio en las trompas de Falopio infectadas es o bien debido a la interrupción de C. trachomatis - las células epiteliales infectadas después de la finalización del ciclo de desarrollo intracelular y la liberación de los cuerpos elementales infecciosos o la liberación de citoquinas pro-inflamatorias 8. Patógenos inducida por daño tisular e indujo host reacciones inmunes contra C. trachomatis se supone que son los principales factores que conducen a la pérdida de la función de las células epiteliales, fibroblastos y la remodelación de la infertilidad tubárica en vivo, finalmente 8,11.

Una de las principales limitaciones de este modelo es la ausencia de células inflamatorias que dificulta el análisis de los efectos secundarios a la inicial C. trachomatis infección del epitelio de las trompas de Falopio. Sin embargo, el modelo es APpropriate para investigar diferentes condiciones ambientales (por ejemplo, contenido de oxígeno) y el primer host de la respuesta inmune en la C aguda trachomatis 8,9. Otros planes son establecer un modelo para la prueba de los antimicrobianos en contra de C. trachomatis en las trompas de Falopio humanos enteros y caracterizar los estados metabólicos de las diferentes etapas evolutivas observadas en el epitelio de las trompas de 2-fotones microscopía de escaneo láser.

Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la DFG-Cluster de Excelencia "La inflamación en las interfaces" (AR-Si, RA-D). Estamos muy agradecidos por la excelente asistencia técnica de Kristin Wischnat.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios
DMEM PAA E15-843
RPMI PAA R15-802
FCS PAA A15-101
Cicloheximida Sigma - Aldrich
SPG de búfer diversos ver receta a continuación
Fijador de Monti diversos ver receta a continuación
tampón de cacodilato de sodio diversos ver receta a continuación
Richardson la mancha diversos ver receta a continuación

Recetas:

1. SPG de búfer

  1. Añadir 75 g de sacarosa.
  2. Añadir 2,47 g de fosfato disódico.
  3. Añadir 0,36 g de fosfato monosódico.
  4. Añadir 0,72 g de ácido glutámico.
  5. Llene hasta 1 litro con agua destilada.
  6. Ajustar el pH a 7.3.

2. Cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,35.

  1. Añadir 42,80 g de ácido dimetilarsénico sal de sodio.
  2. Añadir 68,46 g de sacarosa.
  3. Llene hasta 1 litro con agua destilada. para obtener 0,2 M tampón de cacodilato de sodio.
  4. Antes de utilizar la solución diluida con agua destilada. a deseada concentración y ajustar el pH a 7,35, si es necesario.

3. Fijador de Monti

  1. Añadir 156 ml de 0,12 M tampón de cacodilato de sodio. 3.2 Añadir 25 ml de 25% glutaraldehído en agua destilada.
  2. Añadir 19 ml10% de paraformaldehído en agua destilada.
  3. Añadir 3 ml 3% de CaCl2 en agua destilada.
  4. Ajustar el pH a 7,35 y rellenar con agua destilada. a 312 ml de solución final.

4. Richardson mancha

  1. Mezcle partes iguales de azul de metileno al 1% en solución acuosa al 1% de bórax y el 1% II Azul en agua destilada.

Referencias

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