Research Article
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El medio de oclusión intraluminal modelo cerebral en ratones se presentan en la presente memoria. La extensión del infarto cerebral se evaluó mediante una puntuación neurológica y tinción con violeta de cresilo, una alternativa a la tinción con TTC, que ofrece la gran ventaja de prueba en paralelo marcadores de interés muchos.
El accidente cerebrovascular es la tercera causa de mortalidad y la principal causa de discapacidad en el mundo. Isquémicos cuentas de recorrido para aproximadamente el 80% de todos los accidentes cerebrovasculares. Sin embargo, el trombolítico activador del plasminógeno tisular (tPA) es el único tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo que existe. Estos investigadores llevaron a desarrollar varios modelos de accidente cerebrovascular isquémico en una variedad de especies. Dos tipos principales de modelos de roedores se han desarrollado: modelos de isquemia global cerebral o isquemia cerebral focal. Para imitar el accidente cerebrovascular isquémico en los pacientes, en los cuales aproximadamente el 80% Ataques cerebrales trombóticos o embólicos ocurren en el territorio de la arteria cerebral media (MCA), la oclusión intraluminal de arteria cerebral media (MCAO) el modelo es muy relevante para los estudios de tiempos. Este modelo fue desarrollado por primera vez en ratas por Koizumi et al. En 1986 1. Debido a la facilidad de manipulación genética en ratones, estos modelos también se han desarrollado en este 2-3 especies.
contenido "> Aquí, se presenta el procedimiento de oclusión MCA transitoria en ratones C57/BL6. Estudios previos han informado que las propiedades físicas del dispositivo de oclusión tales como diámetro de la punta, la longitud, la forma y la flexibilidad son fundamentales para la reproducibilidad del volumen de infarto 4. aquí, un monofilamentos silicio comerciales recubiertos (Doccol Corporation) han sido utilizados. Otra gran ventaja es que este monofilamento reduce el riesgo de inducir hemorragias subaracnoideas. Usando el estereomicroscopio Zeiss Stemi 2000, el monofilamento recubierto de silicona se introduce en la arteria carótida interna (ICA) a través de un corte en la arteria carótida externa (ECA) hasta que el monofilamento ocluye la base de la MCA. El flujo sanguíneo fue restaurado 1 hora después de la eliminación del monofilamento para imitar la restauración del flujo sanguíneo después de la lisis de un coágulo en tromboembólica los seres humanos. La extensión de infarto cerebral pueden ser evaluados primero por una puntuación neurológica y por la medición del volumen del infarto.Ratones isquémicos fueron analizados tanto por su puntuación neurológica en diferentes tiempos después de la reperfusión. Para evaluar el volumen del infarto, la tinción con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) se llevó a cabo por lo general. En esto, se utilizó tinción con violeta de cresilo, ya que ofrece la oportunidad de probar muchos marcadores críticos por inmunohistoquímica. En este vídeo, se presenta el procedimiento MCAO, los resultados neurológicos y la evaluación del volumen de infarto por tinción con violeta de cresilo.Oclusión transitoria de la arteria cerebral media (MCAO)
1. Cirugía de Procedimiento (Figura 1)
Oclusión transitoria de la arteria cerebral media (tMCAO) se realiza en 2 - a 3-meses de edad de sexo masculino C57BL / 6 ratones (22-28g). Este protocolo fue aprobado por el cuidado de los animales bioética IRCM comité. Los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron mediante tratamiento en autoclave (121 ° C a 15 psi durante 60 min). Entre cada animal, que fueron esterilizadas mediante el calor esterilizador de cuentas (15 segundos). Mesa de cirugía y otros equipos se desinfectan con 70% de etanol.
Dos horas antes de la cirugía, los ratones se analgesized con buprenorfina (0,03 mg / kg bwip).
Figura 1A.
La figura 1B.
2. Restauración del Medio flujo cerebral sanguíneo de la arteria
Antes de reanesthesia, la neuroscore se pueden comprobar para evaluar el éxito de la cirugía.
3. Sham operación
Para operaciones simuladas, todos los procedimientos son idénticos excepto que el oclusor no está insertada.
4. Neuroscore
Déficits neurológicos permitir la evaluación del éxito de tMCAO justo después de la reperfusión y después de la estimación del grado de gravedad de la lesión. Déficits neurológicos se obtuvo como se ha descrito previamente 5 </ Sup> y realizaron a 1, 24, 48 y 72 horas después de la reperfusión. Una amplia escala de seis puntos se utiliza:
5. Tinción con violeta de cresilo (Figura 2)
Tras la perfusión de solución de PBS, los cerebros se congelaron rápidamente en isopentano y se almacenaron a -80 °C. cerebros de ratón puede ser también perfundidos con paraformaldehído al 4% (PFA) en función de los estudios de inmunohistoquímica planificadas. Criostato de separación de las secciones del cerebro coronal (17 micras) se realizan. Una sección de cada 30 se recogen en la misma diapositiva de sufrir una lesión cerebral representante. Para la cuantificación del volumen, 2 portaobjetos se tiñen mediante tinción con violeta de cresilo y un sistema de análisis de imágenes (Scion Corporation, Frederick, MD) se usó para evaluar la lesión. El volumen de lesión se calculó en unidades arbitrarias (pixeles), y se expresó como un porcentaje de la contralateral no lesionado área de cada sección. Otras diapositivas se guardan a -80 ° C para estudios de inmunohistoquímica. Alternativamente, PFA-fijo cerebro puede ser cortado a 30-50 micras utilizando vibratome y el volumen del infarto medido según lo recomendado por Han et al. (2009) 6.
La evaluación neuroscore confirma el éxito de tMCAO post-apoplejía y determina la eficiencia de la tMCAO después de la reperfusión. En nuestras manos, todos los ratones sometidos al procedimiento intraluminal presenta al menos una leve consistente Curling (neuroscore 2) y los déficit neurológicos son generalmente estables hasta 72 hr. La mayoría de los ratones muestran una leve rizado consistente (neuroscore 2). Los ratones que muestran ausencia de rizado se excluyeron del estudio. Sin embargo, la evaluación neuroscore no nos permite distinguir entre los ratones con un hipocampo lesionado y los que tienen un hipocampo intacto.
No se observó mortalidad durante el día de la cirugía, lo que sugiere que las hemorragias subaracnoideas no ocurrió. Cuando la hemorragia subaracnoidea se identifica en un ratón, éste es sistemáticamente excluidos del análisis. El uso de silicio recubierto con monofilamento de Doccol Corporation, que es más suave que preparados en casa monofilamentos, incrementa el éxito detMCAO y reduce la hemorragia subaracnoidea. La mortalidad entre 24 hr y 72 hr es 14% en este modelo, como generalmente se informó de 60 minutos de oclusión. La mortalidad observada se debe probablemente a un volumen de infarto grande en esta cepa de ratón. Una reproducibilidad lesión fuerte también se ha observado (desviación estándar es 15%), que es muy interesante para estudiar las moléculas de neuroprotección donde podría ser su efecto (s) ocultas por la variabilidad del modelo.
Para evaluar el alcance de la lesión cerebral después de tMCAO, se optó por utilizar tinción con violeta de cresilo (Figura 2) en lugar de TTC con el fin de tener una gran cantidad de materiales a prueba de marcadores relevantes 6. La extensión de la lesión es relativamente consistente. Sin embargo, nos dimos cuenta de que en algunos ratones, el hipocampo se lesionó (alrededor del 30% de los ratones). Es interesante notar que la tinción de violeta de cresilo se puede aplicar hasta 1 semana después. En la literatura, el porcentaje de infarto cerebral varía de unestudiar a la otra. Depende de la elección de la cepa de ratón, la anestesia, el espesor de las secciones del cerebro, el monofilamento usado, o la tinción utilizado 6, 7.
Figura 1. Esquema de la oclusión de la arteria cerebral media utilizando silicio recubierto con monofilamento intraluminal. Un esquema. Simplificado de cerebro de ratón y las arterias cerebrales que muestran suturas sucesivas y clip de preparar la introducción de silicio recubierto con monofilamento. B. La posición de monofilamento a través del círculo de Willis se representa. El monofilamento se introduce en la ACI a través de ECA para ocluir la base de la MCA ACA, la arteria cerebral anterior;. BA, arteria basilar, CCA, arteria carótida común; C. Willis, Círculo de Willis; ECA, la carótida externa artery, ICA, la arteria carótida interna, MCA, la arteria cerebral media, PCA, arteria comunicante posterior, PPA, arteria esfenopalatino.
Figura 2. Representativos secciones coronales de cerebro de ratón teñidas con violeta de cresilo después de 72 horas después de la reperfusión. Área de infarto (principalmente cuerpo estriado, la corteza y las áreas adyacentes del cerebro) aparece en blanco (sin manchas de violeta de cresilo). El volumen de la lesión (parte blanca, hemisferio derecho) se delimitó y se expresó como un porcentaje de la contralateral no lesionado área (hemisferio izquierdo).
Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.
La producción y el libre acceso a este artículo es patrocinado por Zeiss, Inc.
El medio de oclusión intraluminal modelo cerebral en ratones se presentan en la presente memoria. La extensión del infarto cerebral se evaluó mediante una puntuación neurológica y tinción con violeta de cresilo, una alternativa a la tinción con TTC, que ofrece la gran ventaja de prueba en paralelo marcadores de interés muchos.
Este estudio fue apoyado por una subvención CIHR TEAM # 82946 CTP, un CIHR subvención # 102741 MOP, así como una silla de Canadá # 216684 y una Fundación Strauss. ER fue apoyado por una beca de la Fundación del Corazón de Canadá y Stroke.
