Modelo de ratón de MCAO intraluminal: Evaluación del infarto cerebral mediante tinción con violeta de cresilo

El objetivo general de este procedimiento es imitar el accidente cerebrovascular isquémico en ratones. En primer lugar, la arteria carótida común se liga temporalmente, mientras que la arteria carótida externa se liga permanentemente lo más distalmente posible. Otra sutura temporal ligeramente apretada se coloca en el ECA por encima de la bifurcación.

El segundo paso es pinzar la arteria carótida interna con pinzas de acción inversa para evitar el sangrado. A continuación, corte el ECA entre las ligaduras permanentes y temporales. A continuación, se introduce el monofilamento recubierto de silicona en el ECA.

A continuación, se invierte el ECA para introducir el monofilamento en el ICA hasta incluir la base de la arteria cerebral media. Una hora más tarde, el flujo sanguíneo se restablece mediante la extracción del monofilamento para imitar la restauración del flujo sanguíneo después de la lisis de una garra tromboembólica en humanos. En última instancia, el déficit neurológico, que refleja el éxito de la T-M-C-A-O y la gravedad del infarto, se puede evaluar justo después de la reperfusión y en diferentes momentos después de la reperfusión.

El software de imagen cian de los NIH se utiliza para calcular el volumen del infarto en cortes de cerebro representativos teñidos con violeta crestal. Una de las principales ventajas de la oclusión transitoria de la arteria cerebral media mediante la técnica de filamento intraluminal es que imita el ictus isquémico en el paciente con el restablecimiento del flujo sanguíneo y el desarrollo de este procedimiento en ratones ofrece la posibilidad de utilizar una herramienta de genética de etiquetas para identificar el papel de una proteína diana. En el ictus, la oclusión transitoria de la arteria cerebral media se realiza en ratones machos C 57 negros de seis meses de edad de dos a tres meses de edad con un peso de entre 22 y 28 gramos.

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Atención Bioética del IRCM para aumentar la reproducibilidad en el volumen de infarto. Estamos utilizando un monofilamento reutilizable recubierto de silicona de 12 milímetros de largo y seis oh, de Doco Corporation. Dos horas antes de la cirugía.

Inyectar buprenorfina por vía intraperitoneal a un ratón a una dosis de 0,03 miligramos por kilogramo. Para comenzar el procedimiento, anestesiar ratones con 5% de flúor y mantener la anestesia al 2,5% de flúor ISO, use una almohadilla térmica para mantener constante la temperatura corporal del ratón durante la cirugía, desinfecte la piel de helecho del ratón con etanol al 70% o Betadine. A continuación, haga una incisión en la línea media del cuello y separe los tejidos blandos con un microscopio estereoscópico.

Disecciona sin rodeos el cuello del ratón para exponer la tráquea. A continuación, retrae los músculos para localizar la arteria carótida. Diseccione cuidadosamente la arteria carótida común izquierda del tejido circundante.

Coloque una sutura temporal de seda de cinco oh, cortada en segmentos de 20 milímetros alrededor de la arteria. Tenga cuidado de no dañar el nervio vago. A continuación, separe la bifurcación de la arteria carótida común interna izquierda o ICA y la arteria carótida común externa o ECA y coloque una sutura permanente alrededor de la ECA lo más distalmente posible.

Y otra sutura temporal en el ECA por encima de la bifurcación. A continuación, corte el ACI izquierdo con pinzas de acción inversa para evitar el sangrado. Una vez más, tenga mucho cuidado de no dañar el nervio vago.

Cortar un pequeño orificio en el ECA antes de la bifurcación hacia el ECA y el ICA y entre las suturas permanentes y temporales colocadas anteriormente. A continuación, introduzca una sutura de monofilamento recubierta de silicona de seis oh, de 12 milímetros en el ECA, corte completamente el ECA e invierta el monofilamento en el ICA. Ate bien la sutura para evitar sangrado y retire las pinzas de acción inversa.

A continuación, introduzca el monofilamento en el círculo de Willis hasta que el monofilamento ocluya la base del tope MCA. Su inserción unos nueve a 10 milímetros más allá de la bifurcación del ECA y el CCA. Generalmente, el monofilamento se bloqueará y no podrá moverse más.

Tenga cuidado de no penetrar en la arteria tego palatina. Ata bien la sutura en el ECA para fijar el filamento en su posición. Ahora cierre la piel con un sistema de cierre de heridas con clip automático.

Inyecte un mililitro de solución salina por vía subcutánea y coloque a los ratones bajo una lámpara de calentamiento infrarrojo durante el período posterior a la oclusión, que es de 60 minutos. Anestesiar a los ratones como antes y retirar los clips automáticos, abrir ligeramente la sutura del ECA para permitir que el monofilamento se retire y la sangre se vuelva a fusionar. A continuación, ate permanentemente la sutura temporal en el ECA para evitar la pérdida de sangre.

Una hora después de la carrera, retire el monofilamento y guárdelo para su reutilización. A continuación, retire la sutura temporal del CCA para permitir que la sangre vuelva a circular. Cierre la herida y por vía subcutánea.

Inyecte otro mililitro de solución salina en los ratones. Después de asegurarse de que el animal recupere la movilidad, vuelva a colocarlo en su jaula y coloque la mitad de la jaula en la almohadilla térmica para permitir que los ratones elijan su entorno. 12 horas después de la cirugía, los ratones reciben otra dosis de buprenorfina para todas las operaciones simuladas.

Todos los procedimientos son idénticos, excepto que el monofilamento no se inserta después de la cirugía. Se evalúa el déficit neurológico para confirmar el éxito del T-M-C-A-O y determinar su eficiencia: puntuar los déficits neurológicos de los ratones a las 1, 24, 48 y 72 horas después de la perfusión en una escala de seis puntos de la siguiente manera, cero es igual a normal, uno es igual a leve, girando con o sin enroscamiento inconsistente cuando se recoge por la cola. Más del 50% intenta enroscarse hacia el lado contralateral.

Dos equivalen a un rizado leve y consistente sobre el 50% de los intentos de enroscarse hacia el lado contralateral. Tres es igual a un curling consistente, fuerte e inmediato. El ratón mantiene una posición curvada durante más de uno o dos segundos.

Con la nariz casi llegando a la cola. Cuatro equivale a un curling severo. Progresando hacia la pérdida de la marcha o del reflejo de la escritura, cinco equivale a coma o montículo.

Después de la perfusión con la solución de PBS, brisa los cerebros rápidamente en pentano isop y guárdelos a menos 80 grados Celsius. Tenga en cuenta que los cerebros de los ratones también pueden perfundirse con aldehído paraformado al 4% dependiendo de los estudios inmunohistoquímicos planificados. A continuación, utilice un criostato para cortar secciones de cerebro coronal de 17 micras utilizando 30 portaobjetos.

Coloque una sección de cada 30 en el mismo portaobjetos. A continuación, tiñe la primera y la 15ª diapositivas con violeta crestal. Para una estimación más precisa del volumen de la lesión, utilice un sistema de análisis de imágenes como Scion image de los NIH para evaluar la lesión deli, el área del infarto que aparece blanca en los hemisferios cerebrales izquierdo y derecho.

Repita esta limitación D en todos los cortes de cerebro. Calcular el volumen del infarto en unidades arbitrarias y expresarlo como porcentaje del área no lesionada contralateral para cada sección. Mantenga los otros portaobjetos a menos 80 grados centígrados para estudios de inmunohistoquímica.

La evaluación de la puntuación neurológica confirma el éxito de T-M-C-A-O en mi sometido al procedimiento intraluminal. Como se ve aquí, se observa un enroscamiento consistente, fuerte e intermedio y el ratón mantiene una posición enroscada durante más de uno o dos segundos con la nariz casi llegando a la cola. En nuestro experimento, todos los ratones presentaron al menos un leve rizado consistente, lo que corresponde a una puntuación neurológica de dos durante todo el período de prueba.

Se realizó una tinción con violeta de Kressel para evaluar la extensión del infarto cerebral. Después de T-M-C-A-O se muestra aquí una sección coronal representativa del cerebro de ratón teñida con cresta violeta después de 72 horas después de la reperfusión. El área del infarto, principalmente el cuerpo estriado y la corteza y las áreas cerebrales adyacentes, que están etiquetadas aparecen en blanco, ya que no están manchadas por la cresta.

El violeta que se muestra aquí es el volumen de la lesión, que es la parte blanca del hemisferio derecho expresada como un porcentaje del área contralateral no lesionada en el hemisferio izquierdo. El volumen de infarto en ratones C 57 negros seis machos después de un accidente cerebrovascular isquémico representa alrededor del 70% del hemisferio no atado. Este procedimiento proporciona una fuerte reproducibilidad de la lesión.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un accidente cerebrovascular isquémico transitorio en ratones. Además, el enfoque de la viola del cuestionario para medir el volumen de su cerebro en realidad, le ofrece la gran ventaja de tener una gran cantidad de materiales para probar marcadores relevantes por inmunoquímica. Gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.