Modelo de ratón de MCAO intraluminal: Evaluación del infarto cerebral mediante tinción con violeta de cresilo

El objetivo general de este procedimiento es imitar el accidente cerebrovascular isquémico en ratones. Primero, la arteria carótida común se liga temporalmente, mientras que la arteria carótida externa se liga permanentemente lo más distal posible. Otra sutura temporal, ligeramente apretada, se coloca en la ACE por encima de la bifurcación.

El segundo paso consiste en ocluir la arteria carótida interna utilizando pinzas de acción inversa para evitar sangrado. A continuación, corte la AEC entre las ligaduras permanente y temporal. Luego, se introduce el monofilamento recubierto de silicona en la AEC.

Luego, se invierte la ECA para introducir el monofilamento en la AIC hasta incluir la base de la arteria cerebral media. Una hora después, se restablece el flujo sanguíneo mediante la retirada del monofilamento, lo que simula la recuperación del flujo sanguíneo tras la lisis de un coágulo tromboembólico en humanos. Finalmente, el déficit neurológico, que refleja el éxito de la O-C-A-M-T y la gravedad del infarto, puede evaluarse inmediatamente después de la reperfusión y en diferentes momentos posteriores a la reperfusión.

El software Cyan de los NIH se utiliza para calcular el volumen de infarto en cortes cerebrales representativos teñidos con violeta de genciana. Una de las principales ventajas de la oclusión transitoria de la arteria cerebral media mediante la técnica del filamento intraluminal es que simula el accidente cerebrovascular isquémico en pacientes con la restauración del flujo sanguíneo, y el desarrollo de este procedimiento en ratones ofrece la posibilidad de utilizar herramientas de genética marcada para identificar el papel de una proteína diana. En el modelo de accidente cerebrovascular, se realiza la oclusión transitoria de la arteria cerebral media en ratones macho C57BL/6 de dos a tres meses de edad que pesan entre 22 y 28 gramos.

Este protocolo fue aprobado por el Comité de Bioética y Cuidados del IRCM para aumentar la reproducibilidad en el volumen de infarto. Estamos utilizando un monofilamento reutilizable de doce milímetros de largo, de seis oh, recubierto de silicona, de la corporación Doco. Dos horas antes de la cirugía.

Administre una inyección intraperitoneal de buprenorfina a un ratón a una dosis de 0,03 miligramos por kilogramo. Para comenzar el procedimiento, anestesie los ratones con 5% isoflurano y mantenga la anestesia al 2,5% de isoflurano; utilice una almohadilla calefactora para mantener constante la temperatura corporal del ratón durante la cirugía. Desinfecte la piel del abdomen del ratón con etanol al 70% o Betadine. A continuación, realice una incisión media en el cuello y separe los tejidos blandos bajo un microscopio estereoscópico.

Disecar directamente el cuello del ratón para exponer la tráquea. A continuación, retraer los músculos para localizar la arteria carótida. Disecar cuidadosamente la arteria carótida común izquierda del tejido circundante.

Coloque una sutura temporal de seda de cinco hilos, cortada en segmentos de 20 milímetros, alrededor de la arteria. Tenga cuidado de no dañar el nervio vago. A continuación, separe la bifurcación de la arteria carótida común interna izquierda o ICA y la arteria carótida común externa o ECA, y coloque una sutura permanente alrededor de la ECA lo más distal posible.

Otra sutura temporal más en la ECA por encima de la bifurcación. A continuación, ocluya la AIC izquierda utilizando pinzas de acción inversa para evitar sangrado. Nuevamente, tenga mucho cuidado de no dañar el nervio vago.

Corte un pequeño orificio en la AEC antes de la bifurcación hacia la AEC y la AIC y entre las suturas permanentes y temporales colocadas previamente. A continuación, introduzca una sutura monofilamento recubierta de silicona de 12 milímetros y seis hilos en la AEC, corte completamente la AEC e invierta el monofilamento hacia la AIC. Anude firmemente la sutura para evitar sangrado y retire las pinzas de acción inversa.

Luego introduzca el monofilamento en el círculo de Willis hasta que el monofilamento ocluya la base de la arteria cerebral media. Su inserción debe ser de aproximadamente nueve a diez milímetros más allá de la bifurcación de la arteria carótida externa y la arteria carótida común. Por lo general, el monofilamento se bloqueará y no podrá avanzar más.

Tenga cuidado de no penetrar la arteria tegopalatina. Ate firmemente la sutura en la ECA para fijar el filamento en su posición. Ahora cierre la piel con un sistema automático de cierre de heridas con clips.

Inyecte un mililitro de solución salina por vía subcutánea y coloque a los ratones bajo una lámpara de calor por infrarrojos durante el período post oclusión, que dura 60 minutos. Anestesie a los ratones como antes y retire las pinzas automáticas, abriendo ligeramente la sutura en la ECA para permitir la retirada del monofilamento y la reperfusión sanguínea. Luego, ate de forma permanente la sutura temporal en la ECA para prevenir la pérdida de sangre.

Una hora después del accidente cerebrovascular, retire el monofilamento y guárdelo para reutilizarlo. A continuación, retire la sutura temporal en la ACC para permitir que la sangre recircule. Cierre la herida y subcutáneamente.

Inyecte otro mililitro de solución salina en los ratones. Después de asegurarse de que el animal recupere la movilidad, devuélvalo a su jaula y coloque la mitad de la jaula sobre la almohadilla calefactora para permitir que los ratones elijan su entorno. Doce horas después de la cirugía, los ratones reciben otra dosis de buprenorfina para todas las operaciones simuladas.

Todos los procedimientos son idénticos, excepto que el monofilamento no se inserta después de la cirugía. El déficit neurológico se evalúa para confirmar el éxito de la O-C-A-M-T y determinar su puntuación de eficacia, evaluando los déficits neurológicos de los ratones a las 1, 24, 48 y 72 horas posteriores a la perfusión, en una escala de seis puntos como sigue: cero equivale a normal; uno equivale a leve, girando con o sin encogimiento inconsistente cuando se levantan por la cola. Más del 50 % de los intentos de encogerse hacia el lado contralateral.

Dos equivale a un rizo suave y constante en más del 50 % de los intentos de rizo hacia el lado contralateral. Tres equivale a un rizo constante, fuerte e inmediato. El ratón mantiene una posición encogida durante más de uno o dos segundos.

Con la nariz casi tocando la cola. Cuatro equivale a un encorvamiento severo. Progresión hacia la pérdida del reflejo para caminar o escribir; cinco equivale a estado comatoso o montículo.

Después de la perfusión con solución PBS, enfríe rápidamente los cerebros en isopentano y almacénelos a menos 80 grados Celsius. Tenga en cuenta que los cerebros de ratón también pueden perfundirse con paraformaldehído al 4% según los estudios de inmunohistoquímica planeados. A continuación, utilice un criostato para cortar secciones coronales del cerebro de 17 µm utilizando 30 portaobjetos.

Coloque una sección de cada 30 en el mismo portaobjetos. Luego tiña el primer y el decimoquinto portaobjetos con violeta de genciana. Para una estimación más precisa del volumen de la lesión, utilice un sistema de análisis de imágenes, como Scion Image del NIH, para evaluar el delimitador de la lesión, el área de infarto que aparece blanca en los hemisferios cerebrales izquierdo y derecho.

Repita esta limitación D en todos los cortes cerebrales. Calcule el volumen del infarto en unidades arbitrarias y expréselo como un porcentaje del área contralateral no lesionada para cada sección. Mantenga las demás muestras a menos 80 grados Celsius para estudios de inmunohistoquímica.

La evaluación del puntaje neurológico confirma el éxito de la O-A-C-M-T en mis sujetos sometidos al procedimiento intraluminal. Como se observa aquí, se produce un encorvamiento consistente, fuerte e intermedio, y el ratón mantiene una postura encorvada durante más de uno o dos segundos, con la nariz casi tocando su cola. En nuestro experimento, todos los ratones presentaron al menos un encorvamiento leve y consistente, lo que corresponde a un puntaje neurológico de dos durante todo el período de prueba.

Se realizó la tinción con violeta de Kressel para evaluar el grado de infarto cerebral. Tras la oclusión de la arteria cerebral media transitoria (T-M-C-A-O), mostrada aquí, se observan secciones coronales representativas del cerebro de ratón teñidas con violeta de Kressel tras 72 horas de reperfusión. El área de infarto, principalmente el estriado y la corteza y áreas cerebrales adyacentes, que están etiquetadas, aparece en blanco ya que no se tiñe con violeta de Kressel.

Violeta indica aquí el volumen de la lesión, que corresponde a la parte blanca del hemisferio derecho expresada como un porcentaje del área contralateral no lesionada en el hemisferio izquierdo. El volumen del infarto en ratones machos C57BL/6 tras un accidente cerebrovascular isquémico representa aproximadamente el 70 % del hemisferio no lesionado. Este procedimiento proporciona una alta reproducibilidad de la lesión.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un accidente cerebrovascular isquémico transitorio en ratones. Además, el enfoque de cuantificación del volumen de daño cerebral ofrece la gran ventaja de disponer de muchos materiales para probar marcadores relevantes mediante inmunoquímica. Gracias por ver este video y buena suerte con su experimento.