El rápido desarrollo de tamaño pequeño y la transparencia del pez cebra son grandes ventajas para el estudio del control inmunitario innato de la infección 1-4. Aquí nos demuestran técnicas para infectar larvas de pez cebra con el hongo patógeno Candida albicans Por microinyección, la metodología usada recientemente para implicar a la actividad de los fagocitos de la NADPH oxidasa en el control del dimorfismo de hongos 5.
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Artículo de método
La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
La candidiasis diseminada causada por el patógeno Candida albicans es un problema clínicamente importante en individuos hospitalizados y se asocia con una mortalidad de 30 a 40% atribuible 6. La candidiasis sistémica es normalmente controlada por la inmunidad innata, y las personas con defectos genéticos en los componentes de células inmunes innatas como la NADPH oxidasa fagocítica son más susceptibles a la candidemia 7-9. Muy poco se sabe sobre la dinámica de la C. la interacción albicans con las células inmunes in vivo. extensa en estudios in vitro han demostrado que fuera del huésped C. albicans, germina en el interior de los macrófagos, y es rápidamente destruido por los neutrófilos 10-14. Los estudios in vitro, aunque útil, no se puede resumir el complejo en un entorno vivo, que incluye el tiempo que dependen de la dinámica de los niveles de citoquinas, archivos adjuntos de la matriz extracelular, y los contactos intercelulares 10, 15-18 La larva de pez cebra ofrece un hospedador vertebrado único y versátil para el estudio de la infección. Durante los primeros 30 días de desarrollo de larvas de pez cebra sólo tienen defensas inmunológicas innatas 2, 19-21, lo que simplifica el estudio de enfermedades como la candidiasis diseminada que son altamente dependientes de la inmunidad innata. El pequeño tamaño y la transparencia de las larvas de pez cebra permitirá imagen de la dinámica de la infección a nivel celular, tanto para hospedante y el patógeno. Larvas transgénico con fluorescencia células inmunes puede utilizarse para identificar los tipos de células específicos implicados en la infección 22-24. Modificados oligonucleótidos antisentido (Morpholinos) se puede utilizar para derribar varios componentes inmunes como la NADPH oxidasa fagocítica y estudiar los cambios en respuesta a fungal infección 5. Además de las ventajas prácticas y éticas de la utilización de un pequeño vertebrado inferior, las larvas de pez cebra ofrece la posibilidad única de la imagen de la batalla campal entre patógeno y huésped tanto intravitally y en color.
El pez cebra se ha utilizado para la infección de modelo para una serie de bacterias patógenas humanas, y ha sido instrumental en importantes avances en nuestra comprensión de la infección por micobacterias 3, 25. Sin embargo, sólo recientemente han patógenos mucho más grandes tales como hongos han utilizado para infectar larva 5, 23, 26, y hasta la fecha no ha habido una descripción visual detallada de la metodología de la infección. Aquí les presentamos nuestras técnicas de microinyección cerebro posterior del ventrículo de Prim 25 el pez cebra, incluyendo nuestras modificaciones de los protocolos anteriores. Nuestros resultados con el modelo de larvas de pez cebra para la infección por hongos difieren de los estudios in vitro y refuerzan la necesidad de examinar la intera huésped-patógenocción en el complejo entorno de la máquina en lugar del sistema simplificado de la placa de Petri 5.
Protocolo
Todos los protocolos de atención de pez cebra y los experimentos se realizaron bajo Cuidado de Animales institucional y el empleo (IACUC) de protocolo A2009-11-01.
1. Morfolino y platos de larvas de inyección
Experimental Duración: * (10-15 minutos)
Grado de dificultad: *
- Para inyecciones de huevo, preparar una solución al 2% de agarosa en agua estéril y microondas. Cuando la solución se haya enfriado vierta un poco de ella en un plato extra profunda Petri (Fisher Scientific) hasta que esté medio lleno. Enfriar en hielo y hacer que la pl....
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Discusión
El método de la microinyección de pez cebra que aquí se presenta se diferencia de Gutzman et al. 34 en que aquí se demuestra la inyección a través de la vesícula ótica en el ventrículo posterior del cerebro de 36 a 48 larvas de HPF. El método que permite describir para inyección consistente de 10-15 levadura en el ventrículo rombencéfalo con daño tisular reducida. Este protocolo produce una infección local que inicialmente se extiende por todo el cuerpo en un 24 hpi (Figura 1) y los .......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer al laboratorio de la Dra. Carol Kim para la formación de microinyección, Clarissa Henry para el asesoramiento relativo a la aceleración el desarrollo del embrión y el uso de los equipos, y Nathan Lawson para contribuir FLI1: peces EGFP. Damos las gracias a los miembros del laboratorio Wheeler y Shawn Paredes para la lectura crítica del manuscrito. También nos gustaría agradecer a Mark Nilan para el cuidado de los peces y el asesoramiento, y Ryan Phennicie y Gabor Cristina de asesoramiento técnico sobre este proyecto. Este trabajo fue financiado por una ayudantía de investigación MAFES a los hermanos K., MAFES Hatch subvención E08....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| Los tanques de desove | Los hábitats acuáticos | 2L | |
| 1,7 ml tubos | Axygen | MCT-175-C | |
| Instant Ocean | Fisher Scientific | S17957C | |
| Adicionales de profundidad placas de Petri | Fisher Scientific | 08 a 757-11Z | |
| Standard placas de Petri | VWR Scientific | 25384-302 | |
| Pipetas de transferencia | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| Extracto de levadura | VWR ScientiFIC | 90000-726 | |
| Peptona | VWR Scientific | 90000-264 | |
| Dextrosa | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Agar | VWR Scientific | 90000-760 | |
| Hemocitómetro desechable | VWR Scientific | 82030-468 | |
| Tampón fosfato salino | VWR Scientific | 12001-986 | |
| Dumont Dumoxel Pinzas | VWR Scientific | 100501-806 | |
| Clavijas de madera | VWR Scientific | 10805-018 | |
| Kimwipes | VWR Scientific | 300053-964 | |
| Bajo DerretirAgarosa | VWR Scientific | 12001-722 | |
| Agarosa para los platos de inyección | VWR Scientific | 12002-102 | |
| Flaming Brown Micropipeta Extractor | Sutter Instruments | P-97 | |
| Varillas de vidrio huecas | Sutter Instruments | BF120-69-10 | Para varillas de vidrio de cristal liso por calentamiento sobre mechero de Bunsen |
| Caja de almacenaje con una pipeta | Sutter Instruments | BX10 | |
| MPPI-3 Sistema de inyección | Instrumentación Científica Aplicada | MPPI-3 | |
| Unidad de presión de retorno | Instrumentación Científica Aplicada | BPU | |
| Micropipeta kit de soporte para | Aplicacionesed Instrumentación Científica | MPIP | |
| Interruptor de pie | Instrumentación Científica Aplicada | FSW | |
| Micromanipulador | Instrumentación Científica Aplicada | MM33 | |
| Base magnética | Instrumentación Científica Aplicada | Base magnética | |
| Tricaína metano sulfonato | Occidental Chemical Inc. | MS-222 | |
| La disección de Alcance | Olimpo | SZ61 arriba SZX-ILLB2-100 de base | |
| Microscopio Confocal | Olimpo | IX-81 con FV-1000 Sistema láser confocal de barrido | |
| TC-7 Cultivo de Tejidos de rodillos de tambor de la rueda con 14 pulgadas de tubo de ensayo | New Brunswick Scientific | TC-7 | |
| Platos de imagen | MatTek Corporación | P24G-1.0-10-F | |
| Puntas de pipeta para la carga de agujas | Eppendorf | 930001007 | |
| Placa de vertido redes | De adaptación de la ciencia Herramientas | TU-1 | |
| Etapa climatizada | Bioptechs Inc. | Delta T-5 | |
| Espátula plana | VWR Scientific | 82027-486 | |
| Los tamices de plástico | Mercancías de Knutsford en línea | 12 cm | |
| Parafilm | VWR Scientific | 52858-000 | |
| Vortex Genie | VWR Scientific | 14216-184 | |
| 16 x 150 mm tubos de Cultura | VWR Scientific | 60825-435 | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | ND 2000 | |
| Rojo fenol | VWR Scientific | 97062-478 | |
| De HCl | VWR Scientific | 87003-216 | |
| NaCl | VWR Scientific | BDH4534-500GP | |
| KCl | VWR Scientific | BDH4532-500GP | |
| MgSO 4 | VWR Scientific | BDH0246-500GP | |
| Ca (NO 3) 2 | VWR Scientific | BDH0226-500GP | |
| HEPES | VWR Scientific | BDH4520-500GP | |
| Morpholinos | GeneTools, LLC |
Referencias
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20, 367-379 (2004).
- Kanther, M., Rawls, J. F. Host-microbe interactions in the developing zebrafish. Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).
- Meeker, N. D., Tr....
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Reimpresiones y permisos
