Summary
감염 THP1 셀과 기생충 - 구조 및 변화 분석
Abstract
Leishmaniasis은 주로 주로 개발 도상국에서 가난한 사람들의 가난에 영향을 미치는, 세계에서 가장 무시 질병 중 하나입니다. 만 350 명 이상이 leishmaniasis을 계약의 위험에 고려하고, 약 2 명의 새로운 환자가 매년 1 발생하고 있습니다. Leishmania donovani는 내장의 leishmaniasis (VL), 질병의 가장 치명적인 형태의 원인이 에이전트입니다. leishmaniasis을 치료하는 데 사용할 수 약물의 선택은 2 제한되어, 현재의 치료는 제한된 효능을 제공하고 많은 사람들이 치료 복용시 독성이 있습니다. 또한, 첫 번째 치료 약물의 대부분은 이미 여러 약물 저항 할 3 증가로 인해 유틸리티를 잃어 버렸습니다. 반 leishmanial 약품의 현재 파이프 라인은 심각하게 소진되었습니다. 지속적인 노력은 새로운 안티 - leishmanial 약물 발견 파이프 라인을 풍부하게하는 데 필요한,이 노력은 체외 검사 모델 적합의 가용성에 의존하고 있습니다.
체외 promastigotes 4 axenic amastigotes의 assays 5에서 주로하지만, 인해 세포 amastigotes에 비해 크게 세포, 생리학 생화학 및 분자 차이 적합하지 않을 수 있습니다 방지 leishmanial 약물 검사에 사용됩니다. 대 식세포 - amastigotes 모델 Assays은 leishmaniasis의 pathophysiological 조건에 가장 가까운 것으로 간주하고, 따라서 체외 검사에 가장 적합한 있습니다. 차별화 된, 비 나누어 인간의 급성 monocytic 백혈병 세포 (THP1)가 분리 된 주요 대 식세포에 대한 대안 (매력을)과 세포 amastigotes에 대해 서로 다른 화합물을 방지 leishmanial 활동을 시금 사용할 수 있습니다.
여기, 우리는 순수한 화합물을 검사 및 찌르다 자연에 대한 Leishmania donovani과 체외에 감염 차별화 된 THP1 세포와 기생충 - 구조 및 전환 분석을 제시ucts 추출물과 세포 Leishmania의 amastigotes에 대한 효능을 결정. 비 나누어 식세포에 THP1 세포의 (1) 차별화, L.와 대 식세포 (2) 감염 : 분석은 다음 단계를 포함 donovani metacyclic promastigotes, 테스트 약물, 감염된 대 식세포 (4) 제어 용해, (5) 자료 / amastigotes의 구조와 promastigotes에 실시간으로 amastigotes (6) 변화에 감염된 세포 (3) 치료. 검정은 promastigotes로 변환하는 능력에 최소한의 영향을 가능한 세포 amastigotes의 거의 완벽한 구조를 달성 할 수 Leishmania에 감염된 THP1 세포의 제어 용해에 대한 세제 치료를 사용하여 최적화되었습니다. 다른 대 식세포 : promastigotes 비율이 최대 감염을 달성하기 위해 테스트되었습니다. 감염의 정량화는 라이브의 변화를 통해 수행되었다 탈출 Leishmania는 알람에 의해 자신의 성장의 promastigotes 및 평가에 amastigotes96 - 웰 microplates에 arBlue fluorometric 분석. 이 분석은 현재 사용되는 현미경, 유전자 변형 리포터 유전자 및 디지털 이미지 분석 assays 비교됩니다. 이 분석은 견고하며 라이브와 죽은 amastigotes 구별되지 않을 수 있습니다 리포터 유전자 및 이미지 분석 assays에 비해 라이브 세포 amastigotes를 측정합니다. 또한, 분석은 반 leishmanial 약의 현재 패널로 확인되어 성공적으로 대규모 순수 화합물의 심사 및 천연 제품 분수 (Tekwani 외.되지 않은)의 라이브러리에 적용되었습니다.
Protocol
1. THP1 세포 배양을 유지하고 하위 문화
- 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 RPMI-1640 배지에 THP1 세포를 (10 % FBS와 산도 7.4 포함) 유지합니다.
- 하위 문화 셀 1x10 6 세포 / ML을 초과 세포 수를 방지하기 위해 일주일에 두 번. 이 자신의 변환 능력을 유지하는 것이 중요합니다.
2. 유지 하위 문화 Leishmania donovani Promastigotes 문화
- L.을 유지 RPMI-1640에 donovani promastigotes (S1, 수단 변형) 26 10 % FBS와 매체 (나트륨 탄산 수소 나트륨 Pyruvate 없음) ° C.
- 하위 문화 L. donovani 20-25x10 6 promastigotes / ml.Caution의 범위에서 높은 세포 농도와 함께 일주일에 두 번 promastigotes : 모든 미디어 솔루션은 사용하기 전에 실내 온도에 가져해야합니다.
3. 9 심는 및 THP1 세포의 차별화6 잘 Microplate 및 16 실의 유리 문화 슬라이드.
- 10% 열 inactivated FBS와 RPMI-1640에 4 일짜리 세포 배양에서 2.5x10 5 세포 / ML (셀 카운트가 10 6 세포 / ML을 초과하지 않아야 함)의 세포 수와 희석 THP1 문화를 준비합니다. 각 16도 챔버 슬라이드 각 96 - 웰 플레이트와 문화 4 ML을위한 문화의 20 ML을 준비했습니다.
- phorbol 12-myristate 희석 세포 배양 정지 13 - 아세테이트 (PMA) (THP1의 차별화를위한) (50 μg / DMSO의 ML의 주식에서 10 μl/20 ML의 문화) (희석 셀 문화에 최종 PMA 농도이어야을 추가 25 NG / ML).
- 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 기생충 - 구조 - 변환 - 검정을 비교하려면 분명 평면 바닥, 96 - 웰 플레이트 및 16 실, 유리, 미세 문화 슬라이드에 동시에 assays을 설정합니다.
- 각도 또는 챔버에 THP1-PMA-처리 셀 200 μl을 투여.
- 96 - 웰 P를 품다세포의 거의 완전한 차별화를 허용 5 % CO 2 인큐베이터 밤 37 ° C에서 lates 및 16도 챔버 슬라이드.
참고 : 일반적으로 정지 성장 THP1 세포, 점착성의 대 식세포로 구별됩니다.
4. Leishmania donovani Promastigotes로 변형 THP1 세포의 감염
- Leishmania donovani promastigotes과 차별화 된 THP1 세포 배양의 감염, 기생충의 대부분은 infective의 metacyclic 단계 (긴 원통형 양식, ~ 5~6일 옛 문화)에 있어야합니다.
- 기생충 비율 1시 10분 THP1 셀은 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 검정과 Promastigote - 구조 - 변환 - 검정 모두에서 감염 최적입니다.
- L.의 희석 문화를 준비 에서 : donovani는 2.5x10 6 기생충 / ML의 기생충 카운트 (기생충의 비율 = 1시 10분 THP1 전지)로 promastigotes2퍼센트 FBS와 RPMI-1640 배지에서 5-6 일짜리 문화.
- 단계 3.5 (THP1 세포 문화의 밤 차별화 후)에서 접시와 챔버 슬라이드를 꺼내 매체를 제거하고 혈청이없는 RPMI-1640 배지로 한 번 셀 문화를 씻는다.
- 주의 세척 후 PMA-치료 혈청 무료, 따뜻한 RPMI-1640 (~ 37 ° C), 중간, L.의 희석 문화 200 μl와 혈청이없는 미디어를 대체와 THP1 세포를 donovani promastigotes (2.5x10 6 기생충 / ML) 단계 4.3에서. 각 판 및 16도 챔버 슬라이드에 THP1 세포없이 THP1 기생충이없는 세포와 기생충의 제어 우물을 설정합니다.
- THP1 세포 배양에 기생충을 추가 한 후, 37시 플레이트와 슬라이드를 길러 ° C, 5 % 기생충은 차별화 된 THP1 세포를 감염 할 수 있도록 24 시간에 대한 CO 2.
5. 시험 의약품 / 화합물에 감염된 대 식세포의 치료
- 테스트Amphotericin B, Pentamidine 및 심사에 대한 표준 안티 leishmanial 의약품 등 Miltefosine. 물이나 DMSO는 등의 시약 테이블에서 언급에서 의약품 / 테스트 화합물의 주식 솔루션을 준비합니다. 6 농도에서 각 약물 화합물을 테스트합니다.
- 순차적으로 2% FBS와 RPMI-1640 배지와 신선한 96 - 웰 플레이트 또는 2 ML 튜브 (챔버 슬라이드에 대한)에 (1:5) 표준 의약품 및 테스트 화합물을 희석. 이 판의 의약품 / 테스트 화합물 농도는 최종 농도의 2 배입니다.
- L.에 감염 문화 판과 챔버 슬라이드를 씻으십시오 donovani의 promastigotes (단계 4.5) 혈청 무료, RPMI-1640 배지로 5 배 이상. 각도 / 챔버에 100 μl 배양액 (2 % FBS와 RPMI-1640)를 추가합니다. 여러 washings은 비 internalized promastigotes의 완전한 제거를 보장 할 필요가 있습니다.
- 각도 또는 챔버에 순차적으로 희석 된 표준 안티 leishmanial 의약품 또는 시험 화합물에서 100 μl 매체를 추가 할 수 있습니다. infec 설정테드 THP1 세포는 각 판 / 챔버 슬라이드에 동시에 약물없이 제어합니다.
- 37 플레이트와 챔버 슬라이드를 길러 ° C, 48 시간에 대한 5% CO 2.
6. 챔버 슬라이드 염색, 형광 현미경 이미징 및 이미지 분석 감염의 정량화 및 약물 치료의 효과
- 48 시간의 배양 후 혈청이없는 RPMI-1640 배지와 챔버 슬라이드에게 3 번 씻는다. 슬라이드에서 플라스틱 챔버 보지 30 초에 메탄올에서 슬라이드를 immersing하여 세포를 해결할 수 있습니다. 건조 공기 흐름에 따라 바이오 후드에 슬라이드를 둡니다.
- (1:2,000), 주식 (10,000 X) 물을 diluting하여 SYBR 그린 I 착색 솔루션을 (5 배) 준비합니다.
- 전 실온에서 15 분을위한 솔루션을 얼룩 희석 SYBR 녹색과 어두운 상황에서 슬라이드를 얼룩, 물 한 번 씻고 건조 공기 흐름에 따라 슬라이드를 두십시오.
- 왠을 통해 전체 유리 coverslip를 삽입설치 매체의 도움으로 네드 슬라이드.
- THP1 세포의 디지털 이미지를 캡처 : 감염 (빈)없이 감염 (제어), 감염된 세포는 함께 니콘 이클립스 90i 형광 현미경을 사용하여 다른 dilutions에서 다른 표준 의약품이나 시험 화합물 (그림 3, 5, 6))로 치료 NIS 요소 AR 3.2 소프트웨어를 사용하여.
- 대 식세포의 핵 (큰) 및 기생충 핵 (kinetoplast과 작은) 국립 보건원 (에서 개발 공개적으로 - 가능한 자바 기반의 이미지 처리 프로그램입니다 ImageJ (그림 7)를 사용하여 카운트 http://rsb합니다. info.nih.gov / 엘 제이 / download.html ). 100 당 amastigotes의 수는 THP1 세포를 변형으로 데이터를 표현한다.
7. 기생충 - 구조 - 변환 - 검정 : L.의 제어 용해 donovani Amastigotes에 감염된 대 식세포
- 단계에서 96 잘 microplate을 씻으 5.5 세 혈청이없는 RPMI-1640 배지와 시간.
- 다른 농도, 30에 0.05 % SDS 처리에서 시험 다른 세제 중 sec는 제어 용해 (구출 기생충 '생존의 최소 손실과 최대 세포 용해)에 대한 최적입니다.
- 마지막 세척 후 각 우물에서 혈청 무료 미디어를 제거하고 각 잘에 RPMI-1640의 20 μl를 (0.05 % SDS로)를 추가합니다. 30 초에 판을 흔들어서 각 우물 (10 % FBS 포함) RPMI-1640 180 μl 전체를 추가합니다.
- promastigotes에 구조 amastigotes의 변화에 대한 48 시간에 26 ° C에서 접시를 품다.
8. 변형 Promastigote의 정량 분석 (alamarBlue 분석)
- 26 48 시간의 배양 후 ° C가 모두 구출 라이브 amastigotes이 promastigotes (그림 1D)로 변환됩니다. 96 - 웰 P의 각도에 alamarBlue의 10 μl를 추가합니다lates.
- 26 ° C 하룻밤에 번호판을 품다.
- 박 부화 후 544 나노 미터 여기, 590nm 방출에 Fluostar 갤럭시 fluorimeter (BMG 연구소 기술)에 표준 형광의 접시를 참조하십시오.
- ExcelFit (그림 7-9)와 컴퓨팅 IC 이러한 곡선에서 50 / IC 90 값 (표 1)과 함께 복용 응답 곡선 (약물 또는 시험 화합물의 %의 성장 대 농도) 준비합니다.
9. 기생충 비율에 THP1 셀의 표준화
- 분석의 감도를 결정하는 기생충의 비율로 THP1 세포를 표준화. 참고 : 낮은 / 기생충 번호 고 / 감염이 감도 및 심사의 선택성을 손상시킬 수 있습니다.
- 프로토콜을 사용 비교를 제외하고 (제 3, 4) THP1 셀 시딩하고 Leishmania promastigote 감염 위에서 설명한 따라 기생충 비율 THP1 셀을 표준화1:1.25, 1:2.5, 1시 5분 및 1시 10분과 같은 기생충에 THP1 세포의 erent 비율.
- 16 챔버 슬라이드 (이미지 분석을위한)와 96 - 웰 플레이트 (기생충 - 구조 분석 용) 기생충 구조 및 이미지 분석 assays를 비교하는 형식으로 모두 실험을 설정합니다.
10. 제어 세포 용해에 대해 서로 다른 세제의 표준화
- 이 실험의 주요 목적은 크게 구출 amastigote의 기생충의 생존에 영향을주지 않고 전체 / 최대 THP1 셀 용해를 달성 할 수있는 THP1 세포의 제어 용해에 대한 프로토콜을 최적화하는 것입니다.
- 다른 농도 및 치료의 다른 기간 (그림 2)에서 이러한 십대 초반 20 대 초반 80, 트리톤 X-100, NP-40와 SDS 등 다양한 세제를 테스트합니다.
- 기생충 비율 THP1 전지는 1시 10분하고 다른 조건은 위의 섹션 1-8으로 비슷합니다.
- 다른 치료 시간의 0.05 % SDS 치료 더 테스트S는 추가로 제어 세포 용해를 최적화합니다.
Representative Results
정량 분석은 24, 48, 72 및 96 시간 후 약물 치료를 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 기생충 - 구조 - 변환 - 검정 모두 이루어졌다
L.의 직접 계산 방법, 감염의 donovani에 감염된 대 식세포 (THP1 세포)은 다음 식에 의해 계산 :
amastigotes (amastigotes의 핵을 계산에 의해 결정) / 100 THP1 세포 (THP1 세포 핵에서 계산 계산에 의해 결정) (그림 7)이 감염된 THP1 세포의 비율보다 다른 표준 또는 시험 화합물의 효과를 분석 할 수있는보다 정확한 측정하기위한 한 방법입니다 변환 이 번호는 직접 화합물의 전체적인 효과에 관한되기 때문에 같은, 일부 이전 신문에 보도 중 감소를 통해대 식세포의 cells.Infection에서 대 식세포 셀이나 기생충 총 제거에서 기생충의 다양한 시간 간격 (그림 10, 표 1)에 대해 서로 다른 dilutions에 다른 표준 약물로 치료가 감염된 THP1 세포의 디지털 이미지에서 계산되었다. 기생충 - 구조 - 변환 - 검정을위한 상대 형광 단위 (RFU)였다 읽기 아웃하면서 읽기 아웃은 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 검정을위한 amastigotes infection/100는 THP1 세포를 변형 한 직접 감염된 대 식세포에서 구출 라이브 Leishmania의 amastigotes의 수에 비례하여 promastigotes로 변환 할 수 있습니다. alamarBlue 분석은 정기적으로 Leishmania promastigotes 방지 leishmanial 약물 검사에 사용됩니다.
검정은 처음 표준화 및 Leishmania에 감염된 THP1 세포의 제어 용해에 최적화했다. 목표는 세제 화려 조건을 최적화하는 것이 었습니다구조 amastigotes의 생존에 최소한의 효과 THP1 세포의 거의 완전한 용해를 얻을 수 atment는. 그림 1은 전체 분석 프로토콜의 미세한보기를 도시한다. Leishmania의 amastigotes에 감염 그대로 THP1 셀이 그림 1A에서 볼 수 있습니다. 그림 1B는 세제 치료 후 THP1 세포의 용해를 보여줍니다. 그림 1C가 부분적으로 promastigotes와 그림 1D로 변신 한 Leishmania amastigotes를 구출 표시하기에 amastigotes의 거의 완전한 변화를 보여줍니다 promastigotes 및 후속 확산. 이러한 변화 promastigotes의 성장은 양적 alamarBlue의 추가 및 microplate 리더에 형광 측정을 모니터링 할 수 있습니다. NP-40 (그림 2A) 및 트라이 튼 X-100 (그림 2B)와 치료는 감염된 THP1 세포를 lysed하지만, 또한 생존에 영향을하고구조 amastigotes의 변화. 십대 초반 20 (그림 2C)과 십대 초반 80 (그림 2D)의 치료는 변형 promastigotes의 낮은 숫자로 표시로 amastigotes의 불완전한 구조로 인해 THP1 세포의 최적의 용해가되지 않았다. 30 초에 0.05 % SDS (그림 2E)의 치료는 Leishmania에 감염된 THP1 세포의 거의 완전한 용해가 생긴과 탈출의 amastigotes의 생존과 변화에 영향을 미치지 않았다. 또한 최적화 초이 가능한 Leishmania의 amastigotes (그림 2 층)의 높은 구조가 생긴 20-30에 0.05 % SDS와 함께 세포의 치료를 보여 주었다. 후속 실험에서, 30에 대한 0.05 % SDS 치료는 초를 사용했습니다. SDS 처리를위한 절차는 하나 또는 여러 개의 플레이트에 대해 동일합니다. 여러 접시에서 SDS 치료는 멀티 채널 피펫과 열에서 열을 구현되었습니다. 혈청 무료 매체는 모두 8 판 중 하나를 열 우물과 20 & 무에서 삭제되었습니다, 0.05 % SDS의 리터는 동일한 열 여덟 우물에 추가와 10 % FBS와 RPMI-1640을 30 초 후 희석되었다. 분석 초기 표준화 동안 접시가 아닌 internalized promastigotes에 대한 현미경으로 확인되었다. 오 washings의 최소 표준 화합물과 세 washings SDS 치료의 7 단계 전에 필요한있었습니다 감염된 대 식세포 세포 치료의 5 단계 전에 기생충의 제거에 필요한습니다. 따라서, 셀은 8 번 세탁하고 눈에 띄는 비 internalized promastigotes는 감염된 THP1 세포의 제어 용해되기 전에 남아 없습니다.
디지털 이미지 분석 및 직접 계산
Leishmania에 감염된 THP1 세포의 디지털 이미지는 (그림 3 SYBR 그린 I.와 착색 특성 kinetoplast의 DNA와 대 식세포의 핵 및 세포 Leishmania의 핵 모두가 형광 필터에서 관찰 된 이후 니콘 이클립스 90i 형광 현미경에 잡혀). 또한, 감염된 THP1 세포의 이미지도 DIC에서 촬영되었다. 이미지 모두가 병합되었을 때, 세포 amastigotes과 THP1 전지의 개요는 (그림 4) 더 명확하게 볼 수 있었다. ImageJ 소프트웨어는 이러한 이미지를 분석하는 데 사용되었다. ImageJ는 건강 (국립 연구소에서 개발 된 공개 도메인, 자바 기반의 이미지 프로세싱 프로그램입니다 http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html ). ImageJ는 Java 플러그인과 기록 매크로를 통해 확장 성을 제공하는 개방형 아키텍처로 설계되었습니다. 사용자 지정 획득, 분석 및 처리 플러그인은 ImageJ에 내장 된 편집기와 자바 컴파일러를 사용하여 개발 할 수 있습니다. ImageJ에 의한 THP1 셀 핵 및 기생충의 핵의 카운트 차등를 들어, 이미지가 ImageJ에 문을 열었습니다. 셀 카운터는 소프트웨어의 플러그인에서 분석 옵션에 발견되었다. 이미지가 초기화되었고 셀 카운터 유형 1 THP1 C에 선정되었습니다예쁜의 핵 및 세포 카운터 타입 2 기생충의 핵 (그림 3)에 선정되었습니다. 미분 계수는 최소한 200 THP1 세포 핵 이러한 THP1 세포 핵에 존재하는 세포 amastigotes에 이루어졌다. 기생충 - 구조 분석 및 이미지 분석 방법의 비교는 서로 다른 대 식세포와 THP1 세포의 감염을 평가되었다 :. promastigote 비율 : promastigotes 비율 (그림 4) 그림 5는 다른 대 식세포에서 THP1 세포의 차등 감염을 나타냅니다. 방법 모두 비교 결과와 대 식세포를 보여 주었다 : 1시 10분의 promastigote 비율이 최적와 재현 감염이 나왔고.
parasite-rescue/transformation 분석 및 디지털 이미지 분석을위한 조건이 최적화 된 후, 이러한 assays의 유틸리티는 반 leishmanial 약물 검사에 대한 평가되었다. Leishmania에 감염된 THP1 전지가 표준의 서로 다른 농도로 치료했다즉 nti-leishmanial 약물 Amphotericin B, 24 일부터 96 시간에 이르기까지 서로 다른 시간 간격에 대한 Pentamidine 및 Miltefosine. 기생충에 대한 실험은 / 변환 분석은 세중의에서 수행 된 구조 및 방법을 계산 직접 세포에 대한 실험은 복제로 이루어졌다. 그림 6은 치료와 Leishmania에 감염된 감염 감염되지 않은, 제어, THP1 세포를 처리 컨트롤의 현미경 이미지를 보여줍니다. 선량 반응 곡선은 기생충 - 구조 및 변화 분석 (변형 기생충 대 약물의 농도)과 이미지 분석 분석 (amastigotes/100 THP1 세포의 수) (그림 7-9)에서 준비되었다. 마약의 IC 50 ExcelFit에 의해 계산되었으며 표 1에 표시됩니다. 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 기생충 - 구조 - 변환 - 분석은 유사한 결과를 보여 주었다. 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 검정은 초기 24 시간 지점 및 48 시간 약물 t 동안 적은 최적이었다reatments, 기생충 - 구조 - 변환 - 검정은 약물 치료 후 24-96 시간 동안의 모든 시간 지점에서보고 된 값보다 일관된 결과를 보여 주었다 동안. 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 기생충 - 구조 - 변환 - 검정과 결과의 이러한 차이는 디지털 이미지 분석 - 직접 세기의 약물 치료의 조기 기간 동안 비 가능한 amastigotes의 존재 때문일 수 있습니다 - 검정.
그림 1. Leishmania donovani의 현미경보기 promastigotes에 구조와 변화를 amastigotes. A - Leishmania amastigotes에 감염 자기편 THP1 세포, B - 제어 용해 C 한 후 점착성의, 감염된 THP1 셀 - 감염된 THP1 대 식세포 세포 D에서 구출 amastigotes에서 Leishmania donovani의 promastigotes을 변화 - 트란의 성장과 확산sformed Leishmania donovani이 promastigotes.
다른 세제와 Leishmania에 감염된 THP1 세포에서 amastigotes의 THP1 세포 구조의 용해의 그림 2. promastigotes에 라이브 Leishmania donovani의 amastigotes과 변화의 최대 구조를 달성하기 감염된 THP1 세포의 제어 용해의 최적화. 분석. 세제의 두 가지 농도 (0.05 % 및 0.1 %) 및 치료를위한 두 가지 기간은 (30 초와 60 초) 테스트되었습니다. RFU는 = 상대 형광 단위입니다. 각 줄이 중복 관찰의 평균을 나타냅니다. [A] NP-40 치료 THP1 세포의 용해를 야기하고 또한 구출 amastigote의 기생충의 생존에 영향을. [B] 트리톤 X-100 treatmeNT는 THP1 세포의 용해를 야기하고 또한 구출 amastigote의 기생충의 생존에 영향을 [C] 십대 초반 80 amastigotes를 구출하기 위해 THP1 세포의 부분적인 용해를 일으켰습니다. [D] 십대 초반 80 amastigotes를 구출하기 위해 THP1 세포의 부분적인 용해를 일으켰습니다. [E ] SDS 치료는 THP1 세포의 거의 완전한 용해의 원인 및 0.05 % / 30에서 구출 amastigotes의 생존에 영향을 미치지 않은 초. [F 20-30에 0.05 % SDS에] 치료 sec는 THP1 세포의 거의 완전한 용해의 원인과 가능한 기생충을 구출 promastigotes로 변환 할 수 amastigotes이 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. Leishmani와 함께 체외에 감염 차별화 된 THP1 세포의 형광 디지털 이미지donovani이 amastigotes. 특성 kDNA 또한 각 기생충 핵으로 볼 수 있습니다. 대 식세포 핵 (MN) (1) 및 기생충의 핵 (PN) (2) 감염의 정량 평가를위한 ImageJ 분석 소프트웨어로 differentially 표시하고 differentially 계산 할 수 있습니다. 정량화가 amastigotes/100 THP1 세포의 숫자로 이루어졌다.
그림 4. 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 검정 (하단 패널)과 기생충 - 구조 - 변환 - 검정 (위 패널) 사이 비교. 대 식세포 : 1시 10분의 promastigote 비율이 최적의 감염을 굴복. 모두 유사한 결과를 보여 주었다. 기생충 - 구조 분석은 몇 가지 배경 값을 보여 주었다. 각 막대 쇼 중복 값 의미합니다.
그림 5 개의 THP1에 의해 Leishmania의 promastigotes에 감염 THP1 셀 :. promastigote 비율입니다. amastigotes/100 THP1 세포의 수와 같은 양적 결과는 그림 4에 표시됩니다.
그림 6. Leishmania donovani에 감염된 THP1 세포의 디지털 이미지는 (형광등 + DIC) 다른 기간에 대한 표준 안티 leishmanial 약물 치료 후 amastigotes. 결과는 amastigotes/100 THP1 세포의 숫자로 정량화 및 치료 컨트롤에 비해 %의 성장을 계산하고 IC 50 값을 결정하는 데 사용되었다.
그림 7.의 비교 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 안티 leishmanial 약물 검사 (Amophotericin B)에 대한 기생충 - 구조 - 변환 - 검정. 감염된 대 식세포는 여러 기간에 대한 표준 항 leishmanial 약물의 다양한 농도로 치료했다. IC 50 (μg / ML) 값은 Excelfit하여 선량 반응 곡선에서 계산되었다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 8.에 대한 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 기생충 - 구조 - 변환 - 분석의 비교nti-leishmanial 약물 검사 (Pentamidine). 감염된 대 식세포는 여러 기간에 대한 표준 항 leishmanial 약물의 다양한 농도로 치료했다. IC 50 (μg / ML) 값은 Excelfit하여 선량 반응 곡선에서 계산되었다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 9.의 비교 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 안티 leishmanial 약물 검사 (Mitefosine)에 대한 기생충 - 구조 - 변환 - 검정. 감염된 대 식세포는 다른 기간에 대한 표준 항 leishmanial 약물의 다양한 농도로 치료했다. IC 50 (μg / ML) 값은 Excelfit하여 선량 반응 곡선에서 계산되었다.큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
| 시험 약물 | 24 시간 | 48 시간 | 72 시간 | 96 시간 | ||||
| IACA B | PRTA C | IACA B | PRTA C | IACA B | PRTA C | IACA B | PRTA C | |
| Amphotericin B | 0.24 ± 0.03 | 0.17 ± 0.01 * | 0.12 ± 0.04 | 0.20 ± 0.07 | 0.06 ± 0.01 | 0.06 ± 0.01 | 0.11 ± 0.03 | 0.10 ± 0.03 |
| Pentamidine | > 10 | 2.55 ± 1.16 * | 2.88 및 PLusmn, 0.58 | 1.43 ± 0.91 | 1.24 ± 0.35 | 1.52 ± 0.16 | 0.71 ± 0.63 | 0.98 ± 0.33 |
| Miltefosine | 0.38 ± 0.02 | 0.19 ± 0.08 * | 0.24 ± 0.06 | 0.30 ± 0.08 | 0.36 ± 0.02 | 0.16 ± 0.06 | 0.21 ± 0.15 | 0.17 ± 0.10 |
표 1. 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 안티 leishmanial 약물 검사에 대한 기생충 - 구조 - 변환 - 분석의 비교. 감염된 대 식세포는 여러 기간에 대한 표준 항 leishmanial 약물의 다양한 농도로 치료했다. IC 50 (μg / ML) 값은 Excelfit (그림 7-9)에 의해 선량 반응 곡선에서 계산 된 시간 후 약물 치료,. B IACA = 이미지 분석 및 직접 계산은검정, C PRTA = 기생충 - 구조 및 변환 분석. 주어진 값은 μg / ML로 IC 50 (기생충의 성장에 50 % 억제를 일으키는 약물의 농도)이며 적어도 세 실험의 평균 ± SD 있습니다. * (<0.05) 통계적으로 다르게 IACA으로 IC 50 값으로 비교했다.
Discussion
대 식세포 - amastigote 모델을 기반으로 안티 leishmanial 약물 검사에 사용할 수 방법은 여러 가지가 있습니다. Assays는 호스트 동물로부터 즉 복막 exudate 전지 (PEC), 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 수집 식세포를 수행 할 수 있습니다 6 골수 유래 대 식세포 (BMM) 또는 마우스와 같은 monocytic 세포 라인에 (J774 및 RAW264.7 ) 7과 인간 (THP1, U937, HL-60) 8 monocytic 세포. 호스트 세포를 나누어 사용하는 assays는 기생충 및 호스트 셀 번호 모두에 마약 활동의 혼란 효과가 고려되어 있는지 확인해야합니다. 이러한 마우스 및 쥐 등 다양한 소스에서 수집 한 차별화 된 주요 대 식세포는 자연에 비 분리하지만, 이러한 세포 준비가 균일 한 세포 집단이 없을 수 있습니다. Monocytic 세포 - 파생 셀 라인은 자연에서 균일하며 대 식세포-amastigote 기반 진단을위한 더 나은 모델입니다. 다른 monocytic 세포 라인 아웃, differentiated THP1 전지는 (인간의 급성 monocytic 백혈병 세포 라인) 비 분리 monolayer를 형성와 기본 절연 식세포에 대한 매력적인 대안을 제공 할 수 있습니다.
대 식세포-amastigote 기반 검사는 여러 가지 방법으로 수행 할 수 있습니다. 9 세기 직접 셀 및 기생충에 따라 클래식 미세 평가는 노동 집약적이다. 자동화의 부재는이 분석의 유틸리티를 제한합니다. 셀의 계산하는 것은 많은 시간이 소요되며, 착색 절차를 통해 기생충의 생존 결정 이후 IC 50 값의 부정확 한 결정을 줄 수 있습니다하는 것은 어렵습니다. 많은 형광 염료와 단클론 항체는 흐름 cytometric assays 10, 11 고용 될 수 있지만, 이러한 assays은 인해 하루 만에 약물 치료의 시간 간격의 적은 감도와 제한으로 제한됩니다. 세포 amastigotes 12,13,14의 성장을 정량화를위한 몇 가지 리포터 유전자의 assays가 있습니다. 자동 판매기에드 검사는 기자 유전자를 사용하여 수도 있지만 이러한 assays는 특정 단점을 가지고있다. 첫째, 이러한 assays의 대부분은 약물 검사 실험에 적합하지 않을 수 있습니다 기자 유전자의 episomal 표현을 유지하기위한 약물 선택이 필요합니다. 리포터 유전자가 도입되는이 방법은 또한 기생충의 생리 특성에 영향을하고 심사에 영향을 미칠 수 있습니다. 리포터 유전자가 episomal 플라스미드의 일부 경우, 기자의 상대적인 출력은 오히려 약물 (14)의 활동에보다 transfected 플라스미드의 사본 번호 (휴대폰에서 휴대폰에 따라 다릅니다)을에 따라 달라질 수 있습니다. 그러나, 어느 게놈 구조를 방해하여 또는 외국 기자 단백질 15의 존재에 의해 생물 결과가있을 수 있습니다, 기생충은 리포터 유전자를 유지하는 선택적 압력을 필요하지 않습니다 변환 일부 기자 기생충. 일부 기자 유전자 기반 assays에 있습니다감성과 배경 활동을 16 문제를 해결합니다. 가장 중요한 것은, 기자의 유전자 표현 assays, GFP 기자 gene15과 특별히 한 많은 라이브와 죽은 세포 amastigotes를 구별하지 않을 수 있습니다. 루시 페라 제 리포터 유전자를 기반으로 Assays는 생활과 죽은 세포 amastigotes 사이에 분별 수 있지만, 이러한 assays를위한 기판 및 셀 용해 버퍼는 대규모 검사 17 비쌉니다. 이러한 단점 및 대 식세포-amastigote 기반의 이전 심사 assays의 한계를 극복하기 위해, 우리는이 기생충 - 구조 및 전환 분석을 개발하고 최적화되었습니다. 이 분석은 좋은 동질성을 가지고 호스트 세포로, 자연에 비 분산하고 THP1 세포에 기반을두고 있습니다.
여기에 설명 된 기생충 - 구조 - 변환 - 검정 분석은 세포 내 amastigotes의 디지털 이미지 분석 - 직접 세기에 따라 분석과 비교합니다. 형광 및 DIC 현미경, 디지털 imag대 식세포의 핵 및 기생충의 핵의 계산 차이에 대한 ImageJ가 전자 분석은 더욱 미세 계수 분석을 수정했습니다. 형광등 필터 및 차동 간섭 대비 (DIC) 필터에서 이미지를 캡처하면 세포 내 기생충보다 정확한 계산을 위해 디지털 이미지의 품질을 개선하였습니다. 형광 및 DIC 두 이미지는 명확 대 식세포 전지 개요 및 형광 세포 핵으로 디지털 이미지를 얻기 위해 병합 할 수 있습니다. 대 식세포의 핵 및 기생충의 핵은 differentially ImageJ으로 인식 할 수 있습니다. 따라서, 디지털 이미지 분석 - 직접 세기 - 분석 및 기생충 - 구조 - 변환 - 검정 모두 자동화 및 대규모 심사 신청의 가능성이 있습니다. 기생충 - 구조 - 변환 - 분석의 중요한 방법은 다음과 같습니다 (A) Leishmania의 promastigotes에 노출 후 THP1 세포 문화의 반복 washings은 비 인턴의 거의 완전한 제거를 위해alized promastigotes와 SDS와 감염된 THP1 세포 (B) 제어 용해. 단계 모두는 자동화 제어 할 수 있으며, 분석의 처리량과 타협해서는 안됩니다. 어떤 경우 시험 약물 / 화합물에 Leishmania 감염 THP1 세포의 노출 후 washings의 두 번째 단계는, 나머지 비 internalized 기생충을 제거합니다. 기생충 - 구조 - 변환 - 검정은 기존 현미경, 리포터 유전자 및 이미지 분석 assays에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 검정은 간단 강력한, 그리고 재현이 대규모 검사를 위해 자동화 할 수 있으며, 따라서 새로운 안티 - leishmanial 약물 발견을위한 대형 화합물 라이브러리의 심사에서 중요한 응용 프로그램이 있어야합니다. 또한, 분석은 체외에서 Leishmania의 실험실 분리는뿐만 아니라, 임상의 감염을 평가 적용 할 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
NCNPR-USDA-ARS 과학 계약 번호 58-6408-2-0009, 미 육군 의료 연구 및 Materiel 명령에 의해 CDMRP 부여 수상 # W81XWH-09-2-0093.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich USA | P1585 | Required for differentiation of THP1 cells. |
| RPMI-1640 Medium | Invitrogen | 23400021 | |
| Lab-TeK Chamber Slide System (16 Chamber) | Thermo Scientific Nunc | 178599 | |
| Clear, Flat-Bottom, 96-Well Plates | BD Falcon | 353075 | Plates to perform 96-well plate assay |
| Amphotericin B | Sigma-Aldrich USA | A4888 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Pentamidine Isothionate Salt | Sigma-Aldrich USA | P 0547 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in DMSO (2 mg/ml) |
| Miltefosine | EMD Biosciences USA | 475841 | Standard anti-leishmanial drug dissolve in serum-free RPMI-1640 medium (prepare fresh) (2 mg/ml) |
| Sodium Stibogluconate | EMD Biosciences USA | 567565 | Standard anti-leishmanial drug prepare in RPMI-1640 with 4% FBS. (1 mg/ml) |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich USA | L 5750 | |
| Fluorescence Microscope | NIKON | ECLIPSE 90i | |
| Fluorescence Microplate Reader | BMG | Polar Star Galaxy | |
| Mounting Medium | Sigma-Aldrich USA | M 1289 | |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012 B | |
| SYBR Green I | Sigma-Aldrich USA | S 9430 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Sci. | 523500 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich USA | P2256 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich USA | M6250 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich USA | P9416 | |
| Tween 80 | Sigma-Aldrich USA | P6474 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich USA | T8787 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492016 |
References
- WHO. Control of the leishmaniasis: report of a meeting of the WHO Expert Committee on the Control of Leishmaniasis. Xii, Geneva. 22-26 (2010).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian J. Med. Res. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H.
- Mikus, J., Steverding, D. A simple colorimetric method to screen drug cytotoxicity against Leishmania using the dye AlamarBlue. Parasitology International. 48 (3), 265-269 (2000).
- Callahan, H. L., Portal, A. C., Devereaux, R., Grogl, M. An Axenic Amastigote System for Drug Screening. Antimicrob. Agents Chemother. 41 (4), 818-822 (1997).
- Seifert, K., Escobar, P., Croft, S. L. In vitro activity of anti-leishmanial drugs against Leishmania donovani is host cell dependent. J. Antimicrob. Chemother. 65 (3), 508-511 (2010).
- Kolodziej, H., Kiderlen, A. F. Antileishmanial activity and immune modulatory effects of tannins and related compounds on Leishmania parasitized RAW 264.7 cells. Phytochemistry. 66 (17), 2056-2071 (2005).
- Maia, C., et al. Infectivity of five different types of macrophages by Leishmania infantum. Acta Tropica. 103 (2), 150-155 (2007).
- Neal, R. A., Croft, S. L. An in vitro system for determining the activity of compounds against the intracellular amastigote form of Leishmania donovani. J. Antimicrob. Chemother. 14, 463-475 (1984).
- Abdullah, S. M., Flath, B., Presber, H. W. Comparison of different staining procedures for the flow cytometric analysis of U-937 cells infected with different Leishmania-species. J. Microbiol Methods. 37 (2), 123-138 (1999).
- Giorgio, C. D., et al. Flow Cytometric Detection of Leishmania Parasites in Human Monocyte-Derived Macrophages: Application to Antileishmanial-Drug Testing. Antimicrob Agents Chemother. 44 (11), 3074-3078 (2000).
- Mandal, S., et al. High throughput screening of Leishmania donovani clinical isolates against drug using a colorimetric β Lactamase assay. Indian J. Exp. Biol. 47 (6), 475-479 (2009).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A. Microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitol. Res. 89 (4), 266-271 (2003).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania Amastigote Grown in macrophages. Am. J. Trop. Med. 72 (5), 600-605 (2005).
- Sereno, D., et al. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitol. Int. 56 (1), 3-7 (2007).
- Gupta, S., Nishi, Visceral leishmaniasis: experimental models for drug discovery. Indian J. Med. Res. 133, 27-39 (2011).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. Infections in macrophages and in animal models. Mol. Biochem. Parasitol. 110 (2), 195-206 (2000).
