Se describe un protocolo en tiempo real videoimaging de la migración neuronal en el cerebro anterior del ratón. La migración de viralmente marcados o injertado precursores neuronales se registró en rebanadas agudas en vivo utilizando de gran campo de imagen fluorescente con un intervalo de adquisición relativamente rápido para estudiar las diferentes fases de la migración de células, incluyendo las duraciones de las fases estacionaria y la migración y la velocidad de migración.
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Artículo de método
Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto
En este artículo
Resumen
Resumen
Existe un importante cuerpo de evidencia que indica que las nuevas neuronas funcionales están constitutivamente generado a partir de un pool endógeno de las células madre neuronales en áreas restringidas del cerebro de los mamíferos adultos. Neuroblastos recién nacidos de la zona subventricular (SVZ) migran a lo largo de la corriente migratoria rostral (RMS) hasta su destino final en el bulbo olfatorio (OB) 1. En el RMS, los neuroblastos migran tangencialmente en las cadenas de envainado por procesos astrocíticos 2,3 utilizando los vasos sanguíneos como soporte estructural y una fuente de factores moleculares necesarios para la migración 4,5. En el OB, los neuroblastos desprenderse de las cadenas y migran radialmente en las diferentes capas bulbares donde se diferencian en interneuronas e integrar en la red existente 1, 6.
En este manuscrito se describe el procedimiento para la migración de células de vigilancia en rodajas agudas del cerebro de roedores. El uso de las rebanadas de agudos permite que la assessment de la migración de células en el microambiente que se parece mucho a las condiciones in vivo y en regiones del cerebro que son difíciles de acceder para imágenes in vivo. Además, se evita la condición de cultivo de largo como en el caso de cultivos de células organotípicos y que eventualmente pueden alterar las propiedades de migración de las células. Precursores neuronales en rodajas agudas se pueden visualizar utilizando la óptica DIC o proteínas fluorescentes. Etiquetado viral de precursores neuronales en la SVZ, injerto de neuroblastos reportero ratones en la SVZ de ratones de tipo salvaje, y el uso de ratones transgénicos que expresan la proteína fluorescente en neuroblastos son todos los métodos adecuados para la visualización de los neuroblastos y después de su migración. El método más tarde, sin embargo, no permite que las células individuales para ser rastreados por largos períodos de tiempo debido a la alta densidad de células marcadas. Se utilizó un microscopio de campo amplio fluorescente vertical equipado con una cámara CCD para conseguir un intervalo de adquisición relativamente rápida (una image cada 15 segundos o 30) para identificar de forma fiable el estacionaria y fases migratorias. Una identificación precisa de la duración de las fases estacionarias y migratorias es crucial para la interpretación inequívoca de los resultados. También se realizó varias adquisiciones z a paso para controlar la migración de los neuroblastos en 3D. De gran campo de imagen fluorescente se ha utilizado ampliamente para visualizar la migración neuronal 7-10. A continuación, se describe el protocolo detallado para el etiquetado de los neuroblastos, la realización de vídeo en tiempo real de imágenes de la migración neuroblast en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto, y el análisis de la migración celular. Si bien el protocolo descrito ejemplifica la migración de neuroblastos en el RMS de adultos, que también se puede utilizar para seguir la migración de células en los cerebros embrionarios y posnatales temprana.
Protocolo
1. Etiquetado de precursores neuronales
Los neuroblastos pueden ser visualizados utilizando ratones transgénicos que expresan selectivamente proteínas fluorescentes en neuroblastos (es decir, DCX-GFP, GFP-GAD67), por estereotácticamente la inyección de partículas virales que codifican las proteínas fluorescentes en la SVZ o RMS, o por injerto a partir de precursores neuronales reportero ratones (es decir , DCX-GFP, GFP-GAD67) en la SVZ de ratones de tipo salvaje. Se describe el procedimiento para el injerto y el etiquetado de los precursores neuronales viral.
La disociación de los neu....
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Discusión
La orientación correcta de los precursores neuronales a las regiones cerebrales apropiadas es un proceso fundamental que subyace en el correcto montaje y funcionamiento de los circuitos neuronales. La gran mayoría de las células migran durante el desarrollo embrionario y en el cerebro postnatal sólo en unas pocas regiones, tales como la circunvolución OB, dentado y el cerebelo, el desplazamiento neuronal todavía tiene lugar. Los mecanismos de orquestar la migración de células en el cerebro postnatal siguen siendo, sin e.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) subvención a ASJK fue parcialmente apoyado por una beca de la Universidad Laval. AS es el receptor de una Cátedra de investigación de Canadá en la neurogénesis postnatal.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| Sacarosa | Sigma | S9378 | |
| La glucosa (ACSF) | EMD | DX0145-3 | |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCI | Sigma | P9541 | |
| MgCl 2 x6H 2 O | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| NaHCO 3 | Sigma | S5761 | |
| NaH 2 PO 4 xH 2 O | EMD | SX0710-1 | |
| CaCl 2 x2H 2 O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| Dextran TexasRed | Invitrogen | D1864 | |
| Dextran CascadeBlue | Invitrogen | D1976 | |
| Glucosa (solución 40X) | Sigma | G8769 | |
| Sodio pyruvat | Gibco | 11360-070 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| HBSS | Gibco | 14170-112 | |
| DNasa I | Sigma | D-5025 | |
| Tripsina-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Medio Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| BSA | EMD | 2930 | |
| Pen / Strep | Life Technologies | 15140-122 | |
| La ketamina / xilazina | CDMV | 5230 | |
| Pipeta Pasteur | VWR | 14672-380 | |
| Tubo cónico de 15 ml | Sarstedt | 62.553.205 | |
| Tubo cónico de 50 ml | Sarstedt | 62.547.205 | |
| Capilares de vidrio (inyección estereotáxica) | WPI | 4878 | |
| Queroseno | EMD | PX0045-3 | |
| Proviodine | Rougier | 65655-1370 | |
| Suture | Stoelting | 50487 | |
| Anafen | CDMV | 11508 | |
| Jeringa 20 cc | VWR | SS-20L2 | |
| Placa de Petri | VWR | 25384-094 | |
| Agar | Laboratoire Mat | AP-0108 | |
| Pegamento | Permabond | 910 | |
| 95% O 2/5% CO 2 | Linde | 24068835 | |
| Hoja | WPI | 501901 | |
| Nylon con malla | Warner Instruments | 64-0198 | |
| Centrífugo | Eppendorf | 5702 000.019 | |
| Pipetear extractor | Sutter Instrument | P-97 | |
| Nanolitros inyector | WPI | B203MC4 | |
| Aparato de inyección estereotáxica | WPI | 502900 | |
| Sistema de perforación Micro | WPI | 501819 | |
| Vibratome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Wide-field microscopio fluorescente | Olimpo | BX61WIF | |
| CCD cámara | Fotometría | CS-HQ2-D | |
| Ultra-quiet imágenes de cámara | Harvard Apparatus | 64-1487 | |
| PH-1Serie 20 calentador plataforma | Harvard Apparatus | 64-0284 | |
| Sistema de calefacción | Warner Instruments | TC-344B | |
| 40X objetivo de inmersión en agua | Olimpo | 1-UM587 | |
| 10X objetivo de inmersión en agua | Olimpo | 1-UM583 | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instruments | DG-4/OF | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | 40000 | |
| Imaris software | Bitplane | BPI-IM70-F1 |
Referencias
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annu. Rev. Neurosci. 32, 149-184 (2009).
- Kaneko, N. New neurons clear the path of astrocytic processes for their rapid migration in the adult brain. Neuron. ....
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Reimpresiones y permisos
