Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Resumen

Fluorescente In situ (FISH) para identificar las transcripciones de mRNA en células individuales permite el análisis de la actividad poligénica tales como la transcripción simultánea de más de un miembro de la Var Multigene familia en Plasmodium falciparum Eritrocitos infectados ¹. La técnica es adaptable y puede ser utilizado en diferentes tipos de genes, células y organismos.

Resumen

La adhesión de Plasmodium falciparum eritrocitos infectados (IE) a receptores humanos endoteliales durante las infecciones de malaria está mediada por la expresión de PfEMP1 variantes de proteínas codificadas por los genes var.

El P. haploide falciparum genoma alberga aproximadamente 60 genes diferentes var de que ha sido único que se cree que ser transcrito por célula en un momento durante la fase sanguínea de la infección. Como tal regulación mutuamente excluyente de la transcripción de genes var que se logra es clara, ya que es la identificación de los genes var individuales o subgrupos de genes var asociados con diferentes receptores y la consecuencia de unión diferencial sobre el resultado clínico de P. infecciones por P. falciparum. Recientemente, el paradigma de la transcripción mutuamente excluyentes ha sido puesta en duda por los ensayos de transcripción basado en individuo P. falciparum identificación única transcripción en infeja células eritrocitarias utilizando ARN hibridación in situ fluorescente (FISH) El análisis de la transcripción de genes var por el parásito en los núcleos individuales de P. falciparum IE ^1.

Aquí, se presenta un protocolo detallado para llevar a cabo la metodología de ARN-FISH para el análisis de la transcripción de genes var en un solo núcleo de P. falciparum infecta los eritrocitos humanos. El método se basa en el uso de digoxigenina y biotina marcado con sondas de ARN antisentido utilizando el TSA Plus fluorescencia sistema de paletas ² (Perkin Elmer), los análisis microscópicos y recién seleccionado P. falciparum IE. El método de hibridación in situ se puede utilizar para controlar la transcripción y la regulación de una variedad de genes expresados ​​durante las diferentes etapas de la P. ciclo de vida falciparum y es adaptable a otras especies de parásito de la malaria y otros organismos y tipos de células.

Protocolo

1. La generación de recién seleccionada eritrocitos infectados

Para este ensayo, los mejores resultados se obtienen cuando se utilizan cultivos recién seleccionadas para la expresión en superficie de la proteína PfEMP1. En este experimento particular la P. 3D7 linaje falciparum fue seleccionado utilizando anticuerpos específicos como se ha descrito anteriormente ^1.

Día 1

1. Cosecha de 200 l de células de sangre envasados ​​de una P. falciparum cultivo que contiene 2-5% IE etapa tardía por centrifugación a 800 xg durante 8 minutos a temperatura ambiente.
2. Se r....

Resultados

La Figura 1 ilustra un diagrama de flujo de los pasos principales y el tiempo de duración de la metodología de ARN FISH.

Una serie de imágenes representativas de bien y mal conservados experimentos manchadas de ARNm de peces utilizando solo P. falciparum IE se muestra en la Figura 2. Este protozoo intracelular tiene un pequeño (1-1.5 m de diámetro) núcleo que se tiñe de azul con DAPI. Veinticuatro horas después de la invasión de los eritrocitos en <.......

Discusión

Análisis de ARN FISH, en contraste con los métodos tales como transferencia Northern y RT-PCR, permite la discriminación de los transcritos de ARNm específicos en el nivel de célula única. Esto hace que sea posible discriminar entre células transcripcionalmente activos e inactivos, en este ejemplo, P. falciparum protozoos parásitos dentro de los glóbulos rojos. Tales células enteras observaciones son a menudo necesarias y puede desentrañar los patrones transcripcionales importantes y novedosas ^1.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido Acético	Sigma / Aldrich	338826-100ml
Albumax medios de comunicación: RPMI 1640 Glutamina solución	Lonza	BE12-115F	500 ml de medio RPMI 1640 5 ml de solución de glutamina
Albumax medios de comunicación: Gentamicina sulfato Albumax-solución	Lonza	BE02-012E	2,5 ml de gentamicina sulfato 50 ml de solución de Albumax
Albumax-solución: hipoxantina	Sigma-Aldrich	H9377	0,8 g de hipoxantina
Albumax-solución: Albumax II	Yonvitrogen	11021-037	200 g Albumax
Albumax-solución: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	4 litros RPMI 1640 Disolver con el imán en el máximo. 50 ° C. Filtrar esterilizar y almacenar a -20 ° C en alícuotas.
Amberlite	Sigma	A5710-110G	Resina para desionizar formamida.
Anti-biotina peroxidasa de cabra pAb	Calbiochem	203206
Anticuerpo anti-DIG	Novus Productos Biológicos	NB100-41330
Anti-fade reactivo con DAPI	Invitrogen	P36931	Los medios de montaje tiene que curar durante 24 h antes de sellar la corredera completamente.
La biotina RNA Labeling Mix	Roche	11685597910
Cámara digital de	Digital Nikon vista DC-F11
Cubreobjetos	Menzel-Glaser	631-1570
frasco de cultivo de 25 cm 2 de superficie Nunclon	Nunc	156340
DEPC	Fluka / Sigma	32490-100ml	1 ml DEPC en 1000 ml de agua deinonized. Añadir una barra de agitación y se agita durante 12 h. Esterilizar en autoclave durante 30 min.
Cámara digital	Digital Nikon vista DC-F11
Dynabeads Proteína A	Invitrogen	10002D
DynaMaq-15 Imán	Invitrogen	123-01D
Bioultra formamida 99%	Fluka/ Sigma	47671-1l-F	Formamida desionizada: 5 g de resina de intercambio iónico por 100 ml de formamida. Se agita 30 min. Filtrar a través de papel Whatman.
. 0 Gelatina solución al 75%: Gelatina	Sigma-Aldrich	G2500	3,75 g de gelatina en 500 ml de RPMI 1640. Calentar a 56 ° C para disolver. Filtrar esterilizar cuando 56 ° C. Almacenar a -20 ° C en alícuotas.
. Gelatina 0 solución de 75%: RPMI 1640	Lonza	BE12-115F	3,75 g de gelatina en 500 ml de RPMI 1640. Calentar a 56 ° C para disolver. Filtrar esterilizar cuando 56 ° C. Almacenar a -20 ° C en alícuotas.
La glutamina solución: L-glutamina	Sigma-Aldrich	G3126	14,6 g L-glutamina en 500 ml de NaCl al 0,9%. Disolver, filtro sterilize y almacenar a -20 ° C en alícuotas.
Glutamina solución: HCl	Sigma	H1758	14,6 g L-glutamina en 500 ml de NaCl al 0,9%. Disolver, filtrar esterilizar y almacenar a -20 ° C en alícuotas.
Solución de hibridación: formamida al 99% de ultra Bio SSC 20x	Fluka / Sigma	47671-1l-F	Total 20 ml, mantener congelado a -20 ° C en alícuotas 10 ml de formamida desionizada
Solución de hibridación: el concentrado 50x de Denhardt	Sigma	D2532	5ml 20xSSC
Solución de hibridación: Levadura tRNARoche reactivo de bloqueo	Sigma	R-6750	2 ml 50x Denhardt 250 l 20 mg por ml de ARNt de levadura
Solución de Hibridación: DNA de esperma de salmón	Fluka / Sigma	31149-106GF	0,4 g Roche reactivo de bloqueo 1 ml de 10 mg por ml de ADN de esperma de salmón (Critical: desnaturalizan salmón spermDNA a 96 ° C durante 5 min antes de añadir a la solución de hibridación)
Hybridizer Thermostar 100 HC4	Quantifoil Instruments GmbH	1004-0011	Puede ser reemplazado por el horno de hibridación y las cámaras de RNasa libre de hibridación rellenados con agua DEPC.
Inmersión en aceite UV transparente, libre de fluorescencia	Sigma	10976-1EA
Microscopio confocal de inmunofluorescencia o	Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish	Disponible en cualquier farmacia
20x PBS: NaCl KCl Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O KH 2 PO 4 DEPC desionizada H 2 O			Adecuar el pH a 7,4 160 g 4 g 23 g 4 g 1 l
Paraformaldehído al 4%	Fluka / Chemika	76240	4 g PFA en 80 ml de PBS / DEPC. Calentar a 65 ° C hasta que se disuelve el PFA. Añadir 20 ml de PBS, permitir que la solución se enfríe. Ajustar el pH a 7,4. Filtrar. Almacenar en alícuotas a -20 ° C.
Paraformaldehído al 4% / ácido acético 5%			950 paraformaldhyde l de ácido acético + 50 l
Pepsina	Sigma / Aldrich	P7000
Conjugado con peroxidasa anti-biotina	Calbiochem	203206
RBC-wash medios de comunicación: RPMI 1640 Glutamina solución	Lonza	BE12-115F	500 ml de RPMI 1640 5 ml de solución de glutamina
RBC-wash medios de comunicación: Sulfato de Gentamicina	Lonza	BE02-012E	2,5 ml de gentamicina sulfato
RNasa	Sigma / Aldrich		Hacer una dosis de 10 mg / ml de solución madre.
RNasa libre de 1,5 ml tubo	Ambion	AM12450
RNasa Zap	Ambion	AM9780
Diapositivas 4 pozos de 11 mm	Thermo Scientific	MENZXER306W
20x SSC: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na citrato x 3 H 2 O (88 g / l) Ajustar a pH 7,0 con HCl 1M
SSC 20x: Citrato de sodio dihidrato	Sigma / Aldrich	W302600	3 M NaCl (175 g / l) 0,3 M Na citrato x 3 H 2 O (88 g / l) Ajustar a pH 7,0 con HCl 1M
SSPE 20x: NaCl	Sigma / Aldrich	S9625	175,3 g de NaCl
SSPE 20x: NaH 2 PO 4	Sigma / Aldrich	S0751	27,6 g NaH 2 PO 4.
SSPE 20x: 4 EDTA en polvo			9,4 g de EDTA en polvo Añadir agua DEPC, ajustar el pH 7,4. AutoHendió durante 20 min
TNB buffer: tampón TNT			10 ml tampón TNT
TNB búfer: reactivo de bloqueo			0,05 g de reactivo de bloqueo Para disolver el reactivo de bloqueo, se calienta la solución a 60 ° C durante una hora con agitación. Conservar a -20 ° C. (Derivado de la Perkin Elmer TSA-protocolo).
TNT tampón: Tris / HCl	Sigma	T1503	1 M Tris / HCl, pH 8,0
TNT buffer: NaCl	Sigma Aldrich	S9625	100 ml
TNT buffer: Tween20	Sigma	93773	5 M NaCl 30 ml 1 ml DEPC dH 2 O869 Ml Ajustar el pH a 7,5 a temperatura ambiente. (Derivado de la Perkin Elmer TSA-protocolo).
TSA más Cyanine3 / fluoresceína sistema	Perkin Elmer	NEL753000IKT	Leer el protocolo de la TSA Plus sistema de fluorescencia paleta cuidadosamente antes de iniciar el experimento.
Tubos de 14 ml estéril	Almeco - CM Aps LAB	91016