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Análisis in vitro de PDZ-dependientes de complejos macromoleculares de señalización CFTR

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DOI:

10.3791/4091

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13 de agosto de 2012

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1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Wayne State University School of Medicine, 2Cardiovascular Research Institute, Wayne State University School of Medicine, 3Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Wayne State University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR), un canal de cloro del epitelio, se ha informado de interactuar con varias proteínas y regular procesos celulares importantes, entre ellos los CFTR PDZ mediadas por motivo de las interacciones han sido bien documentados. Este protocolo describe los métodos que hemos desarrollado para montar un macromolecular CFTR PDZ-dependiente de señalización complejos In vitro.

Resumen

Transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR), un canal de cloruro encuentra principalmente en la membrana apical de las células epiteliales, juega un papel fundamental en la homeostasis de los fluidos 1-3 transepitelial. CFTR se ha implicado en dos enfermedades importantes: la fibrosis quística (FQ) 4 y la diarrea secretora 5. En CF, la síntesis o la actividad funcional de la CFTR Cl-canal se reduce. Este trastorno afecta a aproximadamente 1 de cada 2,500 caucásicos en los Estados Unidos 6. La actividad del CFTR excesiva también ha sido implicado en casos de toxina inducida diarrea secretora (por ejemplo, por la toxina del cólera y estable al calor enterotoxina de E. coli) que estimula la producción de AMPc o GMPc en el intestino 7.

La acumulación de pruebas sugieren la existencia de interacciones físicas y funcionales entre CFTR y un número creciente de otras proteínas, incluyendo transportadores, canales iónicos, receptores, quinasas, fosfatasas, la señalIng. moléculas, y los elementos del citoesqueleto, y estas interacciones entre CFTR y sus proteínas de unión se ha demostrado que ser críticamente involucrada en la regulación mediada por CFTR transporte iónico transepitelial in vitro y también in vivo 8-19. En este protocolo, nos centraremos únicamente en los métodos que ayudan en el estudio de las interacciones entre la cola CFTR carboxilo terminal, que posee un motivo de unión a proteínas [conocido como PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ) motivo], y un grupo de proteínas de andamiaje, que contienen un módulo de unión específica a que se refiere a dominios PDZ. Hasta ahora, varios diferentes PDZ proteínas de andamiaje se ha informado que se unen a la cola carboxilo terminal de CFTR con afinidades diferentes, tales como, las NHERF1 NHERF2, los PDZK1, los PDZK2, Cal (CFTR asociada a ligando), Shank2, y GRASP 20-27. El motivo PDZ en CFTR que es reconocido por PDZ proteínas de andamiaje son los últimos cuatro aminoácidos en el terminal C (es decir, 1477-DTRL-1480 en el ser humano CFTR) 20. Curiosamente,CFTR puede obligar a más de un dominio PDZ de ambos NHERFs y PDZK1, aunque con distintas afinidades 22. Esta multivalencia con respecto a CFTR unión ha demostrado ser de importancia funcional, lo que sugiere que las proteínas PDZ andamio puede facilitar la formación de complejos macromoleculares CFTR señalización para la señalización específicos / selectiva y eficiente en las células 16-18.

Múltiples ensayos bioquímicos se han desarrollado para estudiar CFTR que implica interacciones de proteínas, como la co-inmunoprecipitación, ensayo de pull-down, por pares ensayo de unión, colorimétrico pares ensayo de unión, y el ensayo de ensamblaje complejo macromolecular 16-19,28,29 . Aquí nos centramos en las particularidades del procedimiento de montaje de un PDZ motivo dependiente de CFTR que contiene complejo macromolecular in vitro, que se utiliza ampliamente en nuestro laboratorio para estudiar proteína-proteína o de dominio de dominio-interacciones que implican CFTR 16-19,28,29.

Protocolo

1. Expresión y purificación de proteínas recombinantes de fusión con la etiqueta en las bacterias

  1. Amplificar las regiones definidas de la C-colas (en los últimos 50-100 aminoácidos que contienen los motivos PDZ en C-terminal) de CFTR, LPA 2, MRP2, MRP4, β 2 AR, y NHERFs (de larga duración o dominios PDZ1 o PDZ2 ) por el método PCR.
  2. Clonar los productos de PCR en pGEX4T-1 vector de fusión GST-proteínas (como GST-NHERFs, GST-MRP4 TC), pMAL-C2 vector de las proteínas de fusión MBP-(como MBP-β 2 AR CT, PAM-CFTR CT ), y pET30 para His-S-proteínas de fusión (tales como Su-S-CT CFTR, Su-S-PDZK1).
  3. Transformación en una E. proteasa deficiente coli cepa (BL21-DE3) para minimizar la posible degradación de proteínas recombinantes.
  4. Mantener el cultivo durante la noche a 37 ° C en medio Luria-Bertani (pH 7,0) que contenía los antibióticos adecuados (por ejemplo, ampicilina o kanamicina). Diluir el cultivo durante la noche a 1:10 y crecer durante otras 2 horas a 37 ° C. Enducir con 0,5-1 m M IPTG durante los próximos 4 horas a 30 ° C. Precipitar las células por centrifugación a 8.000 × g durante 10 min a 4 ° C.
  5. Lisar las células en tampón de sacarosa (50 m M de Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, y 10% de sacarosa) que contenía lisozima (1 mg / ml), 0,2% de Triton X-100, y la proteasa inhibidores. Utilizar 20 ml de sedimento de células procedentes de 1 litro de cultivo.
  6. Mezclar en un agitador rotatorio durante 30 min a 4 ° C.
  7. Girar a 20.000 rpm durante 30 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante claro.
  8. En el sobrenadante claro, añadir 1 ml de los siguientes resina / agarosa bolas (50% suspensión en tampón de sacarosa):
    • Glutatión agarosa para las proteínas de fusión GST.
    • Talon cuentas de Sus-S proteínas de fusión.
    • La amilosa resina para las proteínas de fusión MBP.
  9. Mezclar durante 4 horas a 4 ° C en un agitador rotatorio.
  10. Lavar las perlas por resuspensión en PBS 1x (15 ml), mezclando durante 2 millasn, girando a 800 xg durante 2 min, y desechar el sobrenadante. Repita este paso para seis veces.
  11. Eluir la proteína de las perlas usando tampón de elución respectivo (2 tampón de elución ml por 1 ml de perlas).
    • Tampón de elución de proteínas de fusión GST: 25 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 140 m M de NaCl, y 20 m M glutatión reducido.
    • La elución de las proteínas tampón Sus fusión: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 500 m M de NaCl, y 200 m M imidazol.
    • La elución tampón para proteínas de fusión MBP: 20 m M de Tris-HCl (pH 8,0), 200 m M de NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT y 10 m M de maltosa.
  12. Dializar las proteínas eluidas contra 2 l de 1x PBS a 4 ° C (para evitar la degradación de proteínas es posible). Cambio de PBS cada 4 h durante cuatro veces. Concentrar la proteína utilizando un filtro Centricon (10.000 MW de corte, Millipore) y almacena como pequeñas alícuotas a -80 ° C.
  13. Detarmiño la concentración de proteínas por el método de Bradford. Evaluación de la calidad de proteínas por SDS-PAGE utilizando BSA como estándares. Si la integridad de la proteína no es satisfactoria, los procedimientos secundarios de purificación tales como filtración en gel o intercambio iónico puede ser utilizado. (Por ejemplo, hemos utilizado una columna G-75 para purificar más Sepharosa fusión GST-proteína).

2. Cultivo de células y preparación de lisado celular

  1. Cultura de riñón de cría de hámster (BHK), células que sobre-expresan de forma estable CFTR-CFTR en peso y His10-o células BHK que transitoriamente sobre-expresan la bandera-LPA-2 en peso o la bandera de la LPA-2-ΔSTL, y de Madin-Darby de riñón canino (MDCK ) células que sobreexpresan establemente MRP2 en medio esencial mínimo de Eagle (MEM) que contienen 10% de suero fetal de ternero y penicilina / estreptomicina en matraces de poliestireno a 37 ° C con 5% de CO 2.
  2. Cultura riñón embrionario humano 293 (HEK293) células que sobre-expresan de forma estable CFTR en peso y el CFTR His10 en Dulbecco'S medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con fetal al 10% de suero bovino y penicilina / estreptomicina en matraces de poliestireno a 37 ° C con 5% de CO 2.
  3. Lisar las células en tampón de lisis (PBS - 0,2% de Triton-X-100 suplementado con una mezcla de inhibidores de proteasas que contienen 1 m M de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 1 mg / ml de aprotinina, 1 mg / ml de leupeptina, 1 mg / ml de pepstatina); uso 500 l de tampón de lisis para cada plato 60-mm de Petri, y 1000 l de tampón de lisis para cada plato de Petri de 100 mm.
  4. Rock the lisados ​​celulares durante 20 min a 4 ° C, y eliminar el material insoluble por centrifugación a 16.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Determinar la concentración de proteína por el ensayo de Bradford.

3. En la Asamblea in vitro de un complejo macromolecular que contiene CFTR (CFTR PDZK1-MRP4)

  1. En 200 l de buffer de lisis (PBS - 0,2% de Triton X-100 + inhibidores de la proteasa), añadir 20 g purificado GST-MRP4-C-terminal50 bis (CT50) proteína de fusión.
  2. Añadir varias cantidades (0-40 g) de su purificada-S-PDZK1 proteína de fusión.
  3. Mezclar las dos proteínas en un mezclador rotatorio a 22 ° C durante 1-2 h.
  4. Añadir 20 perlas de glutatión l (50% suspensión) en la mezcla de proteínas, y continuar mezclando durante otras 1. Este paso se conoce también como pares de enlace.
  5. Durante este tiempo, preparar las HEK293 lisados ​​de células que sobreexpresan Bandera-CFTR (en peso) como se describió anteriormente en el Paso 2).
  6. Lavar el complejo dos veces con tampón de lisis. Gira a 800 xg durante 1 minuto por cada lavado y cuidado aspirar el sobrenadante después de cada lavado. Tenga cuidado de no chupar las bolas en la parte inferior.
  7. Añadir los anteriormente preparadas HEK293 lisados ​​celulares a las perlas, y mezcle suavemente a 4 ° C durante 3 horas (o durante la noche).
  8. Lavar las perlas extensamente tres veces con tampón de lisis tal como se describe en el Paso 3,6).
  9. Eluir las proteínas con 30 muestras de búfer l (5 x): 0,6 M Tris-HCl (pH 6,8), 50% de glicerol, 2% de SDS, y 0,1% de azul de bromofenol; que contiene 5% β-mercaptoetanol.
  10. Incubar en baño de agua 37 ° C durante 10-15 minutos, y giran a 5.000 rpm durante 30 s para precipitar las cuentas.
  11. Cargar todo el eluato en 4-15% de gel.
  12. Ejecutar SDS-PAGE durante aproximadamente 30-40 min.
  13. Transferir bandas de proteína a la membrana de PVDF, durante 1,5 horas.
  14. Bloque de la membrana en TBS-Tween que contenía 5% de leche sin grasa.
  15. Incubar la membrana con el anticuerpo primario (tales como anti-IgG de CFTR, R1104) a 4 ° C, durante la noche.
  16. Lavar la membrana con TBS-Tween durante 5 minutos, seis veces.
  17. Incubar la membrana con el anticuerpo secundario (como cabra anti-ratón conjugado HRP-anticuerpo nd 2) durante 45 min a 22 ° C.
  18. Lavar la membrana con TBS-Tween durante 5 minutos, seis veces.
  19. Visualizar las bandas de proteínas a través de ECL.
  20. Los datos representativos se muestran en la Figura 1.
jove_title "> 4. Los resultados representativos

Un ejemplo de complejo macromolecular que contiene CFTR de señalización que se montó en vitro se muestra en la Figura 1. Un complejo macromolecular se formó entre MRP4 C-terminal de 50 aminoácidos (MRP4-CT50), los PDZK1 y de larga duración CFTR (Figura 1, abajo). La formación del complejo mayor dosis-dependiente con cantidades crecientes de la proteína intermediario, PDZK1 (Figura 1, parte inferior) 18.

figure-protocol-1
Figura 1. Una representación pictórica del ensayo complejo macromolecular (arriba). Un complejo macromolecular fue detectado in vitro con tres proteínas (GST-CT50-MRP4, Su-S-PDZK1, y la bandera CFTRwt) de una manera dosis-dependiente (abajo) 18.

CFTR NHERF1-β 2 AR (ref. 14) CFTR NHERF2-LPA 2 (ref. 15) CFTR proteínas PDZ-MRP 2 (ref. 17) CFTR PDZK1-MRP4 (ref. 16)
Cuentas de afinidad La amilosa de resina S-proteína de agarosa La amilosa de resina El glutatión agarosa
Purificada proteína-1 MBP-β 2 AR CT Su-S-CFTR CT MBP-CFTR CT GST-MRP4 CT
Purificada proteína-2 GST-NHERF1 GST-NHERF2 GST-proteínas PDZ Su-S-PDZK1
Purificada proteína-3 (o lisados ​​celulares) CFTR en peso o CFTR His10 (BHK o lisados ​​de células HEK) BanderaLPA-2-en peso o la bandera de la LPA-2-ΔSTL (lisados ​​de células BHK) MRP2 (lisados ​​de células MDCK) Purificada Bandera-CFTR en peso o CFTR His10-(o lisados ​​celulares)
Anticuerpo IgG anti-CFTR Anti-Flag HRP Anti-IgG MRP2 Anti-Flag HRP

Tabla 1. Resumen de diversos complejos macromoleculares que contienen CFTR ensamblados in vitro.

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Discusión

En este protocolo, se demostró un método para ensamblar in vitro y la detección de un complejo macromolecular que contiene CFTR señalización utilizando proteínas purificadas (o fragmentos de proteínas) y / o lisados ​​de células como se informó anteriormente 16-19,29,30. Para lograr los mejores resultados los siguientes puntos críticos durante el proceso de preparación requieren una atención especial:

  • Es importante que el pH del tampón de elución se ajustó a 8,0 después de la adición de ...

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Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Nuestro trabajo ha sido apoyado por becas de la American Heart Association (Gran Afiliado Sureste) 0765185B A partir de la concesión en la ayuda, la Fundación Elsa U. Pardee beca de investigación, y la Universidad Estatal de Wayne fondo de intramuros de inicio y de Investigación Cardiovascular del Instituto premio Iniciativa Isis. Este método de in vitro conjunto complejo macromolecular CFTR fue originalmente iniciado por el Dr. AP Naren (Universidad de Tennessee Health Science Center).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios
pGEX4T-1 vectores GE Healthcare 28-9545-49 anteriormente Amersham Biosciences
pMAL-C2 vector New England BioLabs
pET30 vector Merck Chemicals 69077-3 antes Novagen
Glutatión agarosa BD Biosciences 554780
La amilosa de resina New England BioLabs E8021S
Talon cuentas Clontech 635501
glutatión reducido BD Biosciences 554782
imidazol Pescador BP305-50
maltosa Pescador BP684-500
S-proteína de agarosa Merck Chemicals 69704-3 antes Novagen
Anti-Flag HRP Sigma A8592
IgG anti-CFTR Hechas a medida R1104 MAB reconociendo CFTR epítopo 722-734 de AA
Anti-IgG MRP2 Chemicon International MAB4148 Ahora una parte de Millipore

Tabla 2. Reactivos específicos y equipos.

Referencias

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