Toma de muestras de saliva humana Peptidome indígenas que utilizan una sonda de ultrafiltración Lollipop-térmica: Simplificar y mejorar la detección de péptidos de Espectrometría de Masas clínica

Resumen

Teniendo en cuenta las muestras de saliva para la aplicación clínica futura, una piruleta-como ultrafiltración (LLUF) de la sonda fue fabricado para encajar en la cavidad oral humana. El análisis directo de la saliva no digerida por nanoLC LTQ-espectrometría de masas ha demostrado la capacidad de las sondas LLUF para eliminar las proteínas grandes y proteínas de alta abundancia, y hacer poco abundantes péptidos más detectable.

Resumen

A pesar de la saliva humana proteoma y peptidome se han revelado ^1-2 fueron identificados mayormente de tríptico resúmenes de proteínas de la saliva. Identificación de peptidome indígena de la saliva humana sin digestión previa con enzimas exógenas convierte en un imperativo, dado que los péptidos nativos en la saliva humana proporcionan valores posibles para el diagnóstico de la enfermedad, predecir la progresión de la enfermedad y el seguimiento de la eficacia terapéutica. Apropiado de muestreo que es un paso crítico para la mejora de la identificación de la saliva humana peptidome indígena. Los métodos tradicionales de toma de muestras de saliva humana que implica la centrifugación para eliminar los residuos ^3-4 puede ser demasiado tiempo para ser aplicable para su uso clínico. Además, la eliminación de desechos por centrifugación puede ser incapaz de limpiar la mayoría de los patógenos infectados y eliminar las proteínas abundancia de alta frecuencia que dificultan la identificación de peptidome baja abundancia.

Los enfoques convencionales de proteómica que el PRIprimordialmente utilizar la electroforesis bidimensional en gel (2-DE) geles en conjugación con la digestión en gel son capaces de identificar las proteínas de la saliva muchas ^5-6. Sin embargo, este enfoque no es generalmente suficientemente sensible para detectar péptidos y proteínas baja abundancia. Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) basadas en la proteómica es una alternativa que puede identificar las proteínas sin previo 2-DE separación. Aunque este enfoque proporciona una mayor sensibilidad, se necesita generalmente muestra antes de pre-fraccionamiento ⁷ y pre-digestión con tripsina, lo que hace difícil para el uso clínico.

Para eludir el obstáculo en la espectrometría de masas debido a la preparación de la muestra, hemos desarrollado una técnica denominada ultrafiltración capilar (CUF) sondas de ^8-11. Los datos de nuestro laboratorio demostraron que las sondas CUF son capaces de capturar las proteínas en vivo a partir de diferentes microambientes en los animales de una manera dinámica y mínimamente invasiva ^{8 -}11. N centrifugación es necesario ya una presión negativa creada por simplemente retirando la jeringa durante la recogida de muestras. Las sondas de CUF en combinación con LC-MS han logrado identificar las proteínas tríptico-digeridos ^8-11. En este estudio, hemos mejorado la técnica de muestreo de ultrafiltración mediante la creación de una paleta-como ultrafiltración (LLUF) sonda que puede encajar fácilmente en la cavidad oral humana. El análisis directo por LC-MS sin digestión con tripsina mostró que la saliva humana contiene autóctono muchos fragmentos de péptidos derivados de proteínas diferentes. Toma de muestras de saliva con sondas LLUF evitar la centrifugación, pero eliminan eficazmente muchos más grandes y de gran abundancia de proteínas. Nuestros resultados de espectrometría de masas ilustra que muchos péptidos baja abundancia se convirtió detectable después de filtrar proteínas más grandes con sondas LLUF. La detección de péptidos de bajo abundancia de saliva era independiente de la separación de la muestra en varias etapas con la cromatografía. Para la aplicación clínica, las sondas incorporan LLUFd con LC-MS podría ser utilizado en el futuro para controlar la progresión de la enfermedad de la saliva.

Protocolo

1. La creación de sondas LLUF

1. Las membranas de polietersulfona (2 cm ²⁾ fueron selladas con paletas de polipropileno (triángulo de la Universidad de California en San Diego) por las membranas de encolado con epoxi en las fronteras de paletas. Una membrana cargada negativamente polietersulfona con un peso molecular de corte (MWCO) a 30 kDa fue utilizado.
2. Un tubo de teflón de etileno propileno fluorado (diámetro interno / diámetro exterior, 0.35/0.50 cm) se adjunta a una salida del cilindro de una paleta de polipropileno triángulo por lo que la sonda LLUF puede ser conectado a una jeringa de 20 ml.
3. Después de remojar la membran....

Discusión

Hemos encontrado que muchos fragmentos peptídicos existen en la saliva humana sin digerir. Estos son fragmentos de péptidos derivados de las diversas formas de proteínas ricas en prolina, la actina, alfa-amilasa, la globina alfa 1, beta-globina, histain 1, queratina 1, mucina 7, receptor de inmunoglobulina polimérica, satherin, S100A9. Podría haber muchos factores que contribuyen a la producción de péptidos con sitios de escisión indeterminados. Por ejemplo, algunos fragmentos peptídicos pueden ser naturalmente presente.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Polietersulfona membranas	Pall Corporation		30 kDa MWCO
Teflón etileno fluorado tubo de propileno	Upchurch Scientific
Azul dextrano	Sigma
Nano sistema LC	Eksigent
Columna de la trampa C18	Agilent	5065-9913
LTQ lineal trampa de iones-espectrómetro de masas	Thermo Fisher
Sorcerer 2	Sage-N remarRCH
Acetonitrilo-0,1% de ácido fórmico	JT Baker	9832-03	LC / MS de grado
Agua 0,1% de ácido fórmico	JT Baker	9834-03	LC / MS de grado