Artículo de método

Toma de muestras de saliva humana Peptidome indígenas que utilizan una sonda de ultrafiltración Lollipop-térmica: Simplificar y mejorar la detección de péptidos de Espectrometría de Masas clínica

DOI:

10.3791/4108

⸱

7 de agosto de 2012

 ,  , 
1Sanford-Burnham Medical Research Institute, 2Division of Dermatology, University of California, San Diego , 3VA San Diego Healthcare Center, 4Moores Cancer Center, University of California, San Diego

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Teniendo en cuenta las muestras de saliva para la aplicación clínica futura, una piruleta-como ultrafiltración (LLUF) de la sonda fue fabricado para encajar en la cavidad oral humana. El análisis directo de la saliva no digerida por nanoLC LTQ-espectrometría de masas ha demostrado la capacidad de las sondas LLUF para eliminar las proteínas grandes y proteínas de alta abundancia, y hacer poco abundantes péptidos más detectable.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A pesar de la saliva humana proteoma y peptidome se han revelado 1-2 fueron identificados mayormente de tríptico resúmenes de proteínas de la saliva. Identificación de peptidome indígena de la saliva humana sin digestión previa con enzimas exógenas convierte en un imperativo, dado que los péptidos nativos en la saliva humana proporcionan valores posibles para el diagnóstico de la enfermedad, predecir la progresión de la enfermedad y el seguimiento de la eficacia terapéutica. Apropiado de muestreo que es un paso crítico para la mejora de la identificación de la saliva humana peptidome indígena. Los métodos tradicionales de toma de muestras de saliva humana que implica la centrifugación para eliminar los residuos 3-4 puede ser demasiado tiempo para ser aplicable para su uso clínico. Además, la eliminación de desechos por centrifugación puede ser incapaz de limpiar la mayoría de los patógenos infectados y eliminar las proteínas abundancia de alta frecuencia que dificultan la identificación de peptidome baja abundancia.

Los enfoques convencionales de proteómica que el PRIprimordialmente utilizar la electroforesis bidimensional en gel (2-DE) geles en conjugación con la digestión en gel son capaces de identificar las proteínas de la saliva muchas 5-6. Sin embargo, este enfoque no es generalmente suficientemente sensible para detectar péptidos y proteínas baja abundancia. Cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) basadas en la proteómica es una alternativa que puede identificar las proteínas sin previo 2-DE separación. Aunque este enfoque proporciona una mayor sensibilidad, se necesita generalmente muestra antes de pre-fraccionamiento 7 y pre-digestión con tripsina, lo que hace difícil para el uso clínico.

Para eludir el obstáculo en la espectrometría de masas debido a la preparación de la muestra, hemos desarrollado una técnica denominada ultrafiltración capilar (CUF) sondas de 8-11. Los datos de nuestro laboratorio demostraron que las sondas CUF son capaces de capturar las proteínas en vivo a partir de diferentes microambientes en los animales de una manera dinámica y mínimamente invasiva 8 -11. N centrifugación es necesario ya una presión negativa creada por simplemente retirando la jeringa durante la recogida de muestras. Las sondas de CUF en combinación con LC-MS han logrado identificar las proteínas tríptico-digeridos 8-11. En este estudio, hemos mejorado la técnica de muestreo de ultrafiltración mediante la creación de una paleta-como ultrafiltración (LLUF) sonda que puede encajar fácilmente en la cavidad oral humana. El análisis directo por LC-MS sin digestión con tripsina mostró que la saliva humana contiene autóctono muchos fragmentos de péptidos derivados de proteínas diferentes. Toma de muestras de saliva con sondas LLUF evitar la centrifugación, pero eliminan eficazmente muchos más grandes y de gran abundancia de proteínas. Nuestros resultados de espectrometría de masas ilustra que muchos péptidos baja abundancia se convirtió detectable después de filtrar proteínas más grandes con sondas LLUF. La detección de péptidos de bajo abundancia de saliva era independiente de la separación de la muestra en varias etapas con la cromatografía. Para la aplicación clínica, las sondas incorporan LLUFd con LC-MS podría ser utilizado en el futuro para controlar la progresión de la enfermedad de la saliva.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. La creación de sondas LLUF

  1. Las membranas de polietersulfona (2 cm 2) fueron selladas con paletas de polipropileno (triángulo de la Universidad de California en San Diego) por las membranas de encolado con epoxi en las fronteras de paletas. Una membrana cargada negativamente polietersulfona con un peso molecular de corte (MWCO) a 30 kDa fue utilizado.
  2. Un tubo de teflón de etileno propileno fluorado (diámetro interno / diámetro exterior, 0.35/0.50 cm) se adjunta a una salida del cilindro de una paleta de polipropileno triángulo por lo que la sonda LLUF puede ser conectado a una jeringa de 20 ml.
  3. Después de remojar la membrana polietersulfona en la saliva humana en una placa de cultivo (50 mm de diámetro), la presión negativa creada por la retirada de una jeringa. La jeringa con presión negativa condujo el proceso de ultrafiltración para el muestreo de las proteínas de la saliva.
  4. Las sondas se esteriliza con alcohol al 70% durante la noche antes de su uso. Para demostrar el cierre, se coloca las sondas LLUF en una soluciónción que contiene azul de dextrano (50 mg / ml) con una masa molecular medio de 2.000 kDa para 2 h. La ausencia de azul de dextrano en las muestras recogidas indica que no hay fugas desarrollado durante la fabricación de la sonda y de muestreo.

2. Extracción de saliva

  1. Toda la saliva se recogió a partir de tres voluntarios sanos (dos machos y una hembra de entre 20 y 40) que no tomaban medicamentos, sin signos evidentes de gingivitis o caries 6.
  2. Después de enjuagar la boca con agua, las muestras de saliva fueron recogidas por escupir, sin estimulación química, en un recipiente enfriado con hielo.
  3. Todas las muestras se agruparon y se mantuvo en hielo durante el procedimiento de recogida.
  4. Inmediatamente después de la recolección, la saliva (200 l), se aplicó para el muestreo con sondas LLUF. El muestreo se llevó a cabo en una sala de 4 ° C.
  5. Proteínas de la saliva (1,0 g / l) con o sin LLUF colección sonda fueron sometidos directamente a nano-LC masa spectrometry análisis sin la digestión con tripsina. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un ensayo de proteínas Bio-Rad 12.

3. NanoLC LTQ-MS Análisis

  1. Las muestras de saliva no-digerido (5 l) se cargaron directamente a la columna trampa del sistema Eksigent nanoLC por el inyector automático, utilizando 100% de tampón A. (2% acetonitrile/0.1% de ácido fórmico) El nanoLC estaba on-line, junto con un espectrómetro de masas Finnigan LTQ.
  2. Después de la carga y de lavado de la muestra, la válvula se cambió y 500 nl / min gradiente lineal fue entregado a la trampa y la columna de separación (10 cm de longitud, 100 m, id en la casa llenas de Synergi 4 micras, C18). El gradiente fue de 0 a 50% de tampón B (80% acetonitrile/0.1% de ácido fórmico) en 45 min.
  3. Los instrumentos nanoLC LTQ-MS fueron operados en el modo de datos dependiente de Xcalibur. MS / MS espectros de los más fuertes cuatro iones MS encima una intensidad de 1 x 10 5 se recogieron con exclusión dinámicohabilitado y la energía de colisión fijó en 35%.
  4. Cada muestra se realizará dos veces por el sistema de nanoLC LTQ-EM. Las muestras de tres preparaciones separadas fueron utilizados. Esos péptidos detectables en tres muestras separadas se enumeran en las Tablas 1 y 2 suplementarios. Representante de nanoLC LTQ-MS espectros se ilustra en la Figura 3.

4. Análisis de datos y búsqueda de datos de proteínas

  1. Cada archivo RAW se convierte en un archivo utilizando mzXML Readw.exe.
  2. El archivo mzXML fue la entrada en una SEQUEST Sorcerer 2 del sistema y búsquedas en contra de una base de datos generado por el hombre desde el Centro Nacional correspondiente para la Información Biotecnológica (NCBI) de bases de datos utilizando la proteína no enzimática especificidad. La tolerancia de la masa del ión precursor se fijó en 1,5 Da. Una masa molecular de 16 Da se añadió a la metionina de la búsqueda de diferencial para dar cuenta de la oxidación.
  3. Después de la búsqueda SEQUEST, los resultados fueron filtrados automáticamente, validó und muestra PeptideProphet y ProteinProphet [Institute for Systems Biology (ISB)]. PeptideProphet estima una probabilidad global (p) una asignación de puntaje que el péptido es "correcto" frente a "incorrecta" sobre la base de las puntuaciones SEQUEST es (Xcorr, ΔCn, Sp., RSP) y la información adicional de cada secuencia de péptido identificado. ProteinProphet calcula una puntuación de probabilidad 0 a 1 para cada proteína sobre la base de péptidos asignados a MS / MS espectros.
  4. Para minimizar falsas identificaciones positivas se utilizó estrictos criterios de filtro. En primer lugar, el mínimo de corte P puntuación se fija en 0,8 para cualquier péptido aceptada para asegurar error muy baja (mucho menor que 3%) y la sensibilidad razonablemente buena. En segundo lugar, todos los péptidos con> 0,8 puntuación de P deben tener alta correlación cruzada (Xcorr) más bajos al mismo tiempo: 1.9, 2.2 y 3.0 para +1, +2, y la carga 3.

5. La eliminación de las bacterias orales con sondas LLUF

  1. Para determinar la capacidad de sondas LLUF para eliminar elbacterias de la boca, la saliva antes y después de LLUF sonda de recogida (Sección 3) se extendió sobre placas de agar para la detección de bacterias.
  2. Las bacterias aerobias se cultivaron en un antibiótico libre de Lauria-Bertani placa de agar (LB) a 37 ° C durante un día.
  3. Las bacterias anaerobias se cultivaron en una placa libre de antibióticos Brucella agar caldo (BD, Sparks, MD) bajo condiciones anaerobias que utilizan Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) a 37 ° C durante un día.

6. Los resultados representativos

1. La fabricación de sondas de toma de muestras de saliva y LLUF en un entorno imitado por vía oral

Si la saliva de muestreo se puede realizar como chupar una piruleta, el procedimiento se evitará la degradación de la saliva escupido en la 13-14 dispositivos de recolección. Es importante destacar que, también será posible controlar a los pacientes de forma dinámica y localmente de las cavidades orales. Además, si la preparación de la muestra utilizando la saliva se podría simplificar, los clínicos fácilmente facilitar el procedimiento para acelerar su decisión sobre la operación clínica que viene. La espectrometría de masas es una de las técnicas más sensibles para detectar e incluso proteínas de secuencias en un período muy corto de tiempo. Sin embargo, los procedimientos complicados para la preparación de la muestra han obstaculizado la utilización de esta técnica en la clínica. Además, se sabe que el aumento de las proteínas abundancia o proteínas con altos pesos moleculares en muestras clínicas (por ejemplo, amilasa en la saliva) proteínas máscara baja abundancia en el análisis de espectrometría de masas 15-16. Para superar los obstáculos mencionados anteriormente, hemos desarrollado un dispositivo de ultrafiltración piruleta-al igual que el nombre LLUF sondas (Figura 1). Una carga negativa polietersulfona membrana con un MWCO de 30 kDa (Figura 1A, una) se pegó a una paleta de polipropileno (Figura 1a, b). Se coloca delante de la sonda LLUF con la intención de filtrar proteínas más grandes en la saliva. Para imitar el medio ambiente humano por vía oral (Figura 1A, g), Una esponja (Figura 1A, e) se empapó en la saliva en una placa de cultivo (Figura 1A, f). Después de retirar completamente la jeringa (Figura 1A, d), la saliva se filtró comenzó a moverse a lo largo de un tubo conectado (Figura 1A, c), y se recogió.

2. Identificación de la saliva peptidome indígena por nanoLC LTQ-MS

Comparando LC cromatogramas, hemos encontrado cromatogramas distintos de saliva antes y después del muestreo LLUF (Figura 2), lo que indica que hay diferentes composiciones de proteínas en la saliva después del muestreo LLUF. Para determinar las composiciones de proteínas, se emplearon nanoLC-LTQ espectrometría de masas que se sabe que es capaz de péptidos de secuencia rápidamente de una mezcla de proteínas múltiple. Más importante aún, para simplificar la preparación de muestras con fines clínicos, toda la saliva, sin productos químicos o la digestión enzimática se aplicó por nanoLC-LTQ análisis de la EM. Inesperadamente, 131 péptidos quere identificado en la saliva no digerida (Tabla de consulta 1). Estos péptidos son fragmentos derivados de diversas proteínas ricas en prolina, la actina, alfa-amilasa, la globina alfa 1, beta-globina, histain 1, queratina 1, mucina 7, receptor de inmunoglobulina polimérica, satherin, y S100A9. Veintiséis únicos péptidos fueron identificados en la saliva después de la filtración con sondas LLUF (Supplemental Cuadro 2). Estos péptidos son fragmentos principalmente derivados de diversas proteínas ricas en prolina. Los péptidos derivados de proteínas tales como el receptor de inmunoglobulina polimérica (83,24 kDa) y la alfa-amilasa, fueron indetectables, lo que demuestra la capacidad de sondas LLUF en la eliminación de las proteínas más grandes y abundantes. Un espectro MS / MS del péptido PFIAIHAEAESKL correspondiente a un péptido interno de alfa-amilasa se ​​ilustra en la Figura 3A. Lo más desconcertante es, después de la eliminación de proteínas más grandes, 18, ​​de 26 péptidos secuenciados se detecta en la LLUF la sonda en la muestra de saliva (Tabla1). Estos 18 péptidos fueron derivados de proteínas ricas en prolina o proteínas hipotéticas que terminaron con una prolina (P) -. Glutamina (Q) (-PQ),-SR, SP-o-PP C-terminal Figura 3B muestra un MS / MS espectro del péptido PQGPPQQGGHPRPP que se detectó en el LLUF sonda en la muestra de saliva. El péptido puede ser derivado de prolina proteína rica subfamilia HaeIII 1 y 2 (Tabla 1).

figure-protocol-1
Figura 1. Las composiciones de sondas LLUF y ​​muestreo de toda la saliva de imitar la cavidad oral humana Panel A: (a) una polietersulfona semipermeable con un MWCO de 30 kDa, (b) una paleta de polipropileno, (c) un tubo de teflón fluorado de etileno propileno; (d) una jeringa de 20 ml Panel B:. una esponja (e) (una lengua imitada) se empapó en una placa de cultivo (f) que contiene la saliva humana para crearuna artificial cavidad oral humana (g). La presión resultante negativa creada por retirarse completamente una jeringa impulsa el líquido recogido para mover a lo largo de un tubo conectado (flecha) y hacia un espacio creado (punta de flecha) dentro de la jeringa. Bar: 2,0 cm.

figure-protocol-2
Figura 2. Diferencial de LC / MS / MS cromatogramas de saliva antes y después del muestreo. LLUF proteínas (1,0 g / l) en la saliva humana entera se filtraron, sin o con una sonda LLUF. Las proteínas sin digestión tríptica fueron sometidos directamente a nanoLC-LTQ MS que se conjugó con un sistema Eksigent nano LC como se describe en Materiales y Métodos. Los cromatogramas de pico de base (con tiempos de retención 44-mim) de saliva antes (A) y después (B) de muestreo LLUF se ilustra.

figure-protocol-3
Figura 3. Detección de la saliva por peptidome nanoLC-LTQ proteínas de la saliva MS secuenciación. antes (A) y después (B) de muestreo con sondas LLUF se analizaron por nanoLC-LTQ MS como se describe en los procedimientos experimentales. Peptidome saliva derivado de la saliva humana natural sin digestión tríptica se demostraron en las Tablas 1 y 2 suplementarios. Un péptido (PFIAIHAEAESKL) derivado de alfa-amilasa se ​​detectó exclusivamente en una muestra de saliva sin colección con sondas LLUF (A), que ilustra que la capacidad de sondas LLUF en la eliminación de grandes proteínas. Muchos péptidos con-PQ,-SR,-SP-PP o C-terminales fueron únicamente en muestras después de sondas LLUF ultrafiltración. Un (PQGPPQQGGHPRPP) de péptidos derivados de diversas proteínas ricas prolina se muestra (B). MS / MS espectros con características "y" y "b" de la serie iones confirmado la identidad de ambos péptidos.

figure-protocol-4
Figura 4. La eliminación de las bacterias orales que usan sondas durante LLUF. Una sonda LLUF se construyó como se describe en Materiales y métodos. La sonda se coloca en la saliva humana dentro de un entorno imitado por vía oral (Figura 1). La jeringa al final de LLUF sonda fue retirada para crear una presión negativa que condujo el proceso de ultrafiltración para el muestreo de saliva. Durante el muestreo, toda la saliva cruzado selectivamente a través de la membrana polietersulfona y acumulado en el interior de una jeringa. Toda la saliva antes de la toma de muestras con una sonda LLUF sirvió como control. La saliva (10 l) antes y después LLUF sonda de muestreo se extendió sobre placas de agar para la detección bacteriana Panel A:. Saliva con (+ LLUF) y sin (+ LLUF) LLUF sonda de muestreo se extendió de lado a lado sobre un antibiótico libre placa de agar LB a 37 ° C durante un día el Panel B:. La saliva con y sin LLUF sonda de muestreo se extendió sobre una placa de libre de antibióticos Brucella agar caldo debajo condiciones anaeróbicas usando Gas-Pak (BD Biosciences, San Jose, CA) a 37 ° C durante un día. Las bacterias no crecen en placas de agar se propagan con LLUF la sonda en la muestra de saliva, lo que demuestra la capacidad de las sondas LLCF en la eliminación de aeróbica, así como las bacterias anaerobias orales. Bar: 1,0 cm.

Secuencia del péptido / péptido masa medido Número de la accesión Nombre
1 AGNPQGPSPQGGNKPQ
GPPPPPGKPQ
2485.3 		gi | 41349484 Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma 2 de precursores
gi | 41349482 Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma un precursor de
gi | 60301553 Prolina ricos en proteínas BstNI subfamilia 2
2 GGHQQGPPPPPPGKPQ
1576.9 		gi | 4826944 Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2
gi | 9945310 Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia
3 GPPPAGGNPQQPQAPPA
GKPQGPPPPPQGGRPP
3126.2 		gi | 37537692 Prolina ricos en proteína precursora subfamilia BstNI 4
4 GPPPPGGNPQQPLPPPAGKPQ
2028.3 		gi | 113423660 PREVISTO: proteína hipotética
5 GPPPPGKPQGPPPQGDKSRSP
2077.8 		gi | 113423262 PREVISTO: isoforma proteína hipotética 5
gi | 41349482 Prolina ricos en proteínas BstNI subfamilia una isoforma un precursor de
gi | 60301553 Prolina ricos en proteínas BstNI subfamilia 2
gi | 113423663 PREVISTO: proteína hipotética
gi | 41349484 Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma 2 de precursores
gi | 41349486 Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI un precursor de la isoforma 3
6 GPPPPPPGKPQGPPPQ
GGRPQGPPQGQSPQ
2918.5 		gi | 9945310 Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia
7 GPPPQEGNKPQRPPPPGRPQ
2131.3 		gi | 113423660 PREVISTO: proteína hipotética
8 GPPPQGGNKPQGPPPPGKPQ
2030 		gi | 113423663 PREVISTO: proteína hipotética
gi | 41349482 Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma un precursor de
gi | 113423262 PREVISTO: isoforma proteína hipotética 5
gi | 60301553 Prolina ricos en proteínas BstNI subfamilia 2
9 GPPPQGGRPQGPPQGQSPQ
1866.6 		gi | 4826944 Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2
10 GPPQQGGHPPPPQGRPQ
1713.8 		gi | 9945310 Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia
gi | 4826944 Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2
11 GPPQQGGHQQGPPPPPPGKPQ
2083.1 		gi | 9945310 Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia
gi | 4826944 Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2
12 GRPQGPPQQGGHQQGP
PPPPPGKPQ
2512.6 		gi | 4826944 Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2
gi | 9945310 Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia
13 NKPQGPPPPGKPQGPP
PQGGSKSRSSR
2720.2 		gi | 113423262 PREVISTO: isoforma proteína hipotética 5
gi | 113423663 PREVISTO: hyproteínas pothetical
14 PQGPPQQGGHPRPP
1450.1 		gi | 9945310 Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia
gi | 4826944 Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2
15 QGRPQGPPQQGGHPRPP
1791.1 		gi | 4826944 Prolina ricos en proteínas HaeIII subfamilia 2
gi | 9945310 Prolina ricos en proteínas HaeIII una subfamilia
16 SPPGKPQGPPPQ
1186.9 		gi | 113423262 PREVISTO: isoforma proteína hipotética 5
gi | 41349482 Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma un precursor de
gi | 60301553 Prolina ricos en proteínas BstNI subfamilia 2
gi | 113423663 PREVISTO: proteína hipotética
gi | 41349484 Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma 2 de precursores
gi | 41349486 Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI un precursor de la isoforma 3
17 SPPGKPQGPPPQGGNQ
PQGPPPPPGKPQ
2720.3 		gi | 113423663 PREVISTO: proteína hipotética
gi | 41349482 Prolina ricos en proteínas subfamilia BstNI una isoforma un precursor de
gi | 113423262 PREVISTO: isoforma proteína hipotética 5
gi | 60301553 Prolina ricos en proteínas BstNI subfamilia 2
18 SPPGKPQGPPQQEGNKPQ
1870.9 		gi | 37537692 Prolina ricos en proteína precursora subfamilia BstNI 4

Péptidos Tabla 1. Eran exclusivamente detectables en las muestras recogidas LLUF.

Tabla de consulta 1. Haga clic aquí para ver la tabla suplementaria 1 .

Tabla de consulta 2. Haga clic aquí para ver la Tabla 2 suplementario .

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos encontrado que muchos fragmentos peptídicos existen en la saliva humana sin digerir. Estos son fragmentos de péptidos derivados de las diversas formas de proteínas ricas en prolina, la actina, alfa-amilasa, la globina alfa 1, beta-globina, histain 1, queratina 1, mucina 7, receptor de inmunoglobulina polimérica, satherin, S100A9. Podría haber muchos factores que contribuyen a la producción de péptidos con sitios de escisión indeterminados. Por ejemplo, algunos fragmentos peptídicos pueden ser naturalmente presente...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 y R21-I58002-01). Damos las gracias a C. Niemeyer para la lectura crítica del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios
Polietersulfona membranas Pall Corporation 30 kDa MWCO
Teflón etileno fluorado tubo de propileno Upchurch Scientific
Azul dextrano Sigma
Nano sistema LC Eksigent
Columna de la trampa C18 Agilent 5065-9913
LTQ lineal trampa de iones-espectrómetro de masas Thermo Fisher
Sorcerer 2 Sage-N remarRCH
Acetonitrilo-0,1% de ácido fórmico JT Baker 9832-03 LC / MS de grado
Agua 0,1% de ácido fórmico JT Baker 9834-03 LC / MS de grado

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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