Aislamiento y cultivo de células de la cresta neural de embriones murinos del Tubo Neural

Resumen

Aislamiento de cresta neural embrionario del tubo neural facilita el uso de In vitro Métodos para el estudio de la migración, la auto-renovación, y multipotencia de la cresta neural.

Resumen

El embrión de la cresta neural (NC) es una población de progenitores multipotentes que se origina en la cara dorsal del tubo neural, se somete a un epiteliales de transición mesénquima (TEM) y migra a través del embrión, dando lugar a diversos tipos de células ^{de 1-3.} CN también tiene la capacidad única para influir en la diferenciación y maduración de los órganos diana ^4-6. Cuando explantado in vitro, los progenitores NC someterse a la auto-renovación, migrar y diferenciarse en una variedad de tipos de tejidos incluyendo las neuronas y células gliales, células del músculo liso, cartílago y hueso.

Multipotencia Carolina del Norte fue descrita por primera vez a partir de explantes del tubo neural aviar ^7-9. En el aislamiento in vitro de células NC facilita el estudio de la dinámica de Carolina del Norte, incluyendo la proliferación, migración y multipotencia. Seguir trabajando en los sistemas de aves y ratas demostraron que las células explantados NC conservar su potencial de Carolina del Norte cuando se trasplantan de nuevo en el embrión de ¹⁰-13. Debido a estas propiedades inherentes celulares se conservan en explantados progenitores NC, el tubo de ensayo explante neuronal proporciona una opción atractiva para el estudio de la NC in vitro.

Para lograr una mejor comprensión de los mamíferos NC, muchos métodos han sido empleados para aislar poblaciones NC. NC-derivados de los progenitores puede ser cultivado a partir de post-migratorias lugares, tanto en el embrión y el adulto para estudiar la dinámica de la post-migratorias progenitores NC ^11,14-20, sin embargo el aislamiento de progenitores de Carolina del Norte, ya que emigran del tubo neural proporciona una conservación óptima de NC potencial de la pila y propiedades migratorias ^13,21,22. Algunos protocolos emplear fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) para aislar una población NC enriquecido para progenitores particulares ^11,13,14,17. Sin embargo, cuando se inicia con embriones en fase inicial, el número de células adecuadas para el análisis son difíciles de obtener con FACS, lo que complica el aislamiento de principios populatio NCns a partir de embriones individuales. A continuación, describimos un método que no depende de la FACS y los resultados en una población de aproximadamente el 96% pura Carolina del Norte sobre la base de un reportero Wnt1-Cre activado linaje ^23.

El método que aquí se presenta es una adaptación de los protocolos optimizados para el cultivo de ratas NC ^11,13. Las ventajas de este protocolo en comparación con los métodos anteriores son que: 1) las células no se cultivan en una capa alimentadora, 2) FACS no se requiere para obtener una población NC relativamente puro, 3) premigratorias células aisladas se NC y 4) resultados son fácilmente cuantificados. Además, este protocolo se puede utilizar para el aislamiento de NC de cualquier modelo de ratón mutante, lo que facilita el estudio de las características de NC con diferentes manipulaciones genéticas. La limitación de este enfoque es que el CN se retira del contexto del embrión, que se sabe que influyen en la supervivencia, la migración y la diferenciación del CN ^2,24-28.

Protocolo

1. Preparación de las placas

1. Utilizar una técnica estéril en todo momento.
2. Preparar fibronectina (FN) por dilución de 100 l de plasma humano de stock FN en un volumen final de 3,3 ml en PBS de Dulbecco (DPBS). La concentración final es de 30 mcg / ml y esto se puede almacenar a 4 ° C durante 1 semana.
3. Cubrir el fondo de cada pocillo de una cultura estéril del tejido cuatro pocillos con solución de FN y deje reposar durante 15 minutos. Asegúrese de que toda la superficie está cubierta. Hacer medios durante este tiempo (pasos 2 y 3).
4. Quitar FN solución y permita que las placas que se seque. Enjuague suavemente los pocillos con 5....

Discusión

Debe prestarse cuidadosa atención a la etapa de desarrollo del embrión para asegurar el éxito de este enfoque. Contando somitos de embriones tempranos de ratón es fundamental tanto para la etapa correspondiente embriones dentro de una camada y la determinación de las regiones correctas del tubo neural para el aislamiento. Una variación de uno o dos somitas entre embriones está dentro de una gama razonable de tiempo de desarrollo, dependiendo de la resolución del experimento llevado a cabo. Un embrión entre el 9 y el 9,5.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM (glucosa baja)	Gibco / Invitrogen	11885
Medio Neurobasal	Gibco	21103
BSA	Sigma	A3912-10G
DPBS	Gibco	14190-144
IGF1	BD Biosciences	354037	Almacenar en 50 mg / ml alícuotas a -20 ° C.
bFGF	BD Biosciences	354060	Tienda en 25 g / ml alícuotas a -20 ° C.
La fibronectina	Gibco	33016-015	Almacenado en 1mg/mL aliquots a -20 ° C.
El ácido retinoico	Sigma	R2625	Tienda en 35 microgramos / ml alícuotas después de la reconstitución de etanol a -20 º C.
2-mercaptoetanol	Sigma	D-5637
N 2 suplemento	Gibco	17502-048
Suplemento B27	Gibco	17504-044
Filtros de 0,22 micras Steriflip	Millipore	SCGP00525
La penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140122
0,20 micras filtros	Corning	431219
Jeringas (por filtración)	BD Biosciences	301604
Cuatro placas	Thermo Fisher Scientific	176740
Colagenasa / dispasa	Roche	269 ​​638	Actividad varía por lotes. Almacenar en 100 mg / ml alícuotas a -20 ° C.
Agujas de insulina (29 ½ medidor)	Becton Dickinson	309306
Cámara de Hipoxia	Billups-Rothenberg
Analizador de oxígeno	Billups-Rothenberg
Pinzas # 5	Herramientas de Bellas Ciencia		Para quitar el útero y la decidua.
Tripsina-EDTA (0,25%)	Gibco	25200