Un enfoque rápido para investigar las interacciones y efectos en los mecanismos moleculares relacionados con la presencia de anticuerpos en un entorno intracelular se describe. El método implica la transfección de anticuerpos en células vivas utilizando una formación de complejo no covalente basada en una formulación de lípidos. La técnica es adaptable a las líneas celulares inmortalizadas y en células primarias.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
La transfección de anticuerpos en neuronas como una herramienta para estudiar la patogénesis de enfermedades
En este artículo
Resumen
Resumen
Los anticuerpos ofrecen la posibilidad de conocer mejor novela en varios eventos que tienen lugar en los sistemas vivos. La capacidad de producir anticuerpos altamente específicos para las proteínas diana ha permitido preguntas biológicas muy precisas que deben abordarse. Es importante destacar que los anticuerpos han sido implicados en la patogénesis de un número de enfermedades humanas, incluyendo el lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide (AR), los síndromes paraneoplásicos, esclerosis múltiple (MS) y T-linfotrópico humano tipo virus 1 (HTLV-1) asociado mielopatía / paraparesia espástica tropical (HAM / TSP) 1-9. Cómo anticuerpos causar enfermedad es un área de investigación en curso, y los datos sugiere que las interacciones entre los anticuerpos y los diversos resultados de moléculas intracelulares en la inflamación, alterado celular de mensajería, y la apoptosis 10. Se ha demostrado que los pacientes con MS y HAM / TSP producir anticuerpos contra la proteína de unión intracelular de ARN heterogéneo proteína A ribonucleares1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Datos recientes indican que los anticuerpos para tanto intra-neuronal y antígenos de superficie son patógenas 3, 5-9, 11. Por lo tanto, un procedimiento que permite el estudio de anticuerpo intracelular: interacciones proteína daría una gran comprensión de la patogénesis de enfermedades.
Los genes están comúnmente transfectaron en células primarias y líneas celulares en cultivo, sin embargo transfección de anticuerpos en las células se ha visto obstaculizado por la alteración de la estructura del anticuerpo o la eficiencia de transfección pobre 12. Otros métodos de transfección incluyen la transfección de anticuerpo basada en liposomas catiónicos (que consiste de DOTAP / DOPE) y polietileniminas (PEI), ambos de los cuales resultó en una disminución de diez veces en la transfección de anticuerpos en comparación con los controles 12. El método realizado en nuestro estudio es similar al mediada por lípidos catiónicos métodos y utiliza un mecanismo basado en lípidos para formar complejos no covalentes con los anticuerpos a través de electrostática y hydrinteracciones ophobic 13. Hemos utilizado Ab-DeliverIN reactivo, que es una formulación lipídica capaz de capturar anticuerpos a través de interacciones no covalentes electrostáticas e hidrófobas y su entrega dentro de las células. Así química y genética acoplamientos no son necesarios para la entrega de anticuerpos funcionales en las células vivas. Este método nos ha permitido realizar anticuerpo diversos experimentos de rastreo y localización de las proteínas, así como los análisis de las consecuencias moleculares de anticuerpo intracelular interacciones proteína: 9.
En este protocolo, vamos a mostrar cómo transfectar anticuerpos en neuronas rápido, reproducible y con un alto grado de eficiencia de transfección. Como ejemplo, vamos a usar anti-anticuerpos hnRNP A1 y anti-IgG. Para la cuantificación fácil de eficiencia de transfección se utilizó anti-anticuerpos hnRNP A1 marcados con Atto-550-NHS y marcado con FITC IgG. Atto550 NHS es una nueva etiqueta con alta absorción molecular y yi cuánticaeld. Fuente de excitación y filtros fluorescentes para Atto550 son similares a Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Además, Atto550 tiene alta fotoestabilidad. Marcado con FITC IgG se utilizaron como control para demostrar que este método es muy versátil y no teñir dependiente. Este enfoque y los datos que se generan ayudará en la comprensión de la función que los anticuerpos a antígenos diana intracelulares podría desempeñar en la patogénesis de las enfermedades humanas.
Protocolo
1. Anticuerpo Etiquetado (Figura 1)
- Hacer NaHCO3 0,1 M buffer:
- 8,4 g de NaHCO 3
- 29,2 g de NaCl
- 1 litro de H2O
- Llevar el tampón hasta un pH de 8,4 con esta solución (10,6 g de Na 2 CO 3, 29,2 g de NaCl, 1 litro H 2 0).
- Añadir 35 Atto550 NHS mu l a 70 l anti-hnRNPA1 y 500 l NaHCO 3 tampón y girar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de la rotación de una hora de duración, inyectar la mezcla en un dializador y dializar 2 litros de PBS durante la noche.
- El día siguiente, se concentran los dial....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Con el fin de probar las hipótesis sobre moléculas específicas y de su expresión, genes y otros vectores son comúnmente transfectadas en células. El aspecto único de este procedimiento es la capacidad para transfectar fácilmente anticuerpos en las células diana. Se realizó este procedimiento en cinco experimentos separados, cada uno por duplicado. Resultados de transfección de eficiencia fue similar entre todos los experimentos. Es importante destacar que el método permite la entrada de anticuerpos en la célula, sin alt.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo es apoyado por la Oficina de Investigación y Desarrollo, Médico del Servicio de Investigación del Departamento de Asuntos de Veteranos. Este estudio fue financiado por una concesión de mérito revisión VA (a MCL) y la Universidad de Tennessee Health Science Center Fondo Multiple Sclerosis Investigación.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre de Reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| Microscopio fluorescente AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision versión 4.2 | Zeiss | ||
| Lucha contra el rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| Marcado con FITC anti-Rigg | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 éster de NHS | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 10% de FBS antibióticos +1% | Gibco | 11320-033 | |
| Poli-D-lisina 8-así diapositivas Cultura | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Científico IndustriInc es | Modelo 151 | |
| Medios de montaje DAPI | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dializador | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehído (4% de solución) | Microscopía Electrónica de Ciencias | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
Referencias
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
