Artículo de método

Pequeñas y Wide Angle X-Ray Estudios de dispersión de macromoléculas biológicas en disolución

DOI:

10.3791/4160

⸱

8 de enero de 2013

 ,  ,  , 
1Department of Mechanical, Aerospace, and Nuclear Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La demostración de rayos X de pequeño ángulo y gran dispersión (SWAXS) procedimiento ha resultado fundamental en el estudio de macromoléculas biológicas. Mediante el uso de la instrumentación y los procedimientos de los métodos de ángulo específico y la preparación, los datos experimentales de los SWAXS muestra la caracterización atómica y nano escala de macromoléculas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este trabajo, Ángulo Pequeño y Gran dispersión de rayos X (SWAXS) el análisis de las macromoléculas se demuestra a través de la experimentación. SWAXS es ​​una técnica en la que los rayos X son elásticamente dispersada por una muestra homogénea en el rango de nm-en ángulos pequeños (típicamente 0,1 - 5 °) y ángulos anchos (típicamente> 5 °). Esta técnica proporciona información sobre la forma, el tamaño y la distribución de las macromoléculas, distancias características de materiales parcialmente ordenados, tamaños de poros, y la relación de superficie a volumen. De ángulo pequeño dispersión de rayos X (SAXS) es capaz de entregar información estructural de macromoléculas entre 1 y 200 nm, mientras que Wide Angle X-ray (WAXS) puede resolver aún más pequeño espaciamiento de Bragg de muestras entre 0,33 nm y 0,49 nm basado en la configuración específica del sistema y el detector. La separación se determina a partir de la ley de Bragg y es dependiente de la longitud de onda y ángulo de incidencia.

En un experimento SWAXS, los materiales pueden ser sólidoso líquido, y puede contener dominios de sólidos, líquidos o gaseosos (denominadas partículas) del mismo material o de otro en cualquier combinación. SWAXS aplicaciones son muy amplias e incluyen coloides de todo tipo: metales, materiales compuestos, cemento, petróleo, polímeros, plásticos, proteínas, alimentos y productos farmacéuticos. Para muestras sólidas, el espesor está limitado a aproximadamente 5 mm.

El uso de un instrumento de laboratorio basado en SWAXS se detalla en este documento. Con el software disponible (por ejemplo, GNOM-ATSAS 2,3 paquete por D. Svergun EMBL-Hamburgo y software EasySWAXS) para el sistema SWAXS, un experimento puede llevarse a cabo para determinar algunos parámetros de interés para la muestra dada. Un ejemplo de un experimento de macromolécula biológica es el análisis de 2% en peso de lisozima en un tampón acuoso a base de agua que puede ser elegido y preparado a través de numerosos métodos. La preparación de la muestra sigue las directrices indicadas a continuación en la Preparación de la sección de muestra. A través de la experimentación SWAXS,importantes parámetros estructurales de la lisozima, por ejemplo, el radio de giro, se puede analizar.

Protocolo

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1. Preparación de la muestra

  1. Utilice una aguja para extraer parte de la muestra desde el recipiente de la muestra. *
  2. Utilice la aguja para llenar el capilar (diámetro máximo de 2,2 mm) con muestra. El capilar debe ser llenado entre 2 y 3 cm de la parte inferior.
  3. Cierre el capilar por cera derretida en la punta.
  4. Desatornillar el soporte de muestra de vacío del sistema.
  5. Tome el capilar por el extremo fundido (extremo cera) e inserte el extremo no-condensado en el soporte de la muestra.
  6. Coloque el soporte de nuevo en el sistema y el tornillo en su lugar.

* Las muestras sólidas (incluyendo muestras de polvo) puede ser colocado directamente en el soporte de muestras (no capilar es necesario), mientras que las muestras de líquido debe ser colocado en un capilar.

Puesta en marcha de la máquina SWAXS

2. Fuente Procedimiento de arranque en frío

  1. Cierre el obturador pulsando el botón de disparo hasta la seguridad.
  2. Encienda la alimentación principal"ON" pulsando el botón verde en.
  3. Verifique que la emergencia "Shut-Off" está en la posición extendida.
  4. Encienda la alimentación principal pulsando el botón verde.
  5. Verifique que la luz LED de bloqueo es de color verde, indicando todos los bloqueos están bien.
  6. Espere a que la pantalla táctil para cargar. Una vez que se haya cargado, pulse "R6" en el menú.
  7. Gire la llave de espera para la posición "ON".
  8. Gire la Llave de rayos X a la posición "ON". El rojo de luz de rayos X debe encenderse.
  9. Espere a que la pantalla táctil para leer los niveles de reserva (30 kV y 0,4 mA).
  10. Gire la llave de seguridad en espera a la posición "OFF". Pulse la tecla "Cycle Start" en la parte inferior de la pantalla táctil.
  11. Espere a que la pantalla táctil para leer potencia nominal (50 kV y mA 1). Si el nivel de potencia diferente que se desea, entrar en la pantalla de configuración pulsando "R4" en la pantalla táctil e introducir los ajustes deseados.

3. Chiller Procedimiento

  1. Gire el swi podertch a la posición "ON" en el panel de control de temperatura. Una luz de control y la pantalla de temperatura LED se iluminará.
  2. Gire el interruptor de encendido en la posición "ON" en la enfriadora.
  3. Espere hasta que el indicador de temperatura muestra "OFF". Este es el modo de espera.
  4. Mantenga pulsado el botón de entrar (símbolo de retorno) durante unos 4 segundos o hasta que el indicador de temperatura muestra la temperatura actual.
  5. Para cambiar la temperatura, presione las flechas arriba hacia abajo. El valor de ajuste se muestra en la pantalla de temperatura durante aproximadamente 8 segundos hasta que se vuelva al valor real.
  6. Pulse el botón Enter una vez el valor ajustado deseado. Esto almacenará ese valor.
  7. Esperar hasta que la temperatura real alcanza el valor de referencia deseado.

NOTA: Si en cualquier momento el error "E 01" aparece en la pantalla de temperatura, siga las instrucciones de apagado refrigerador, baño de recarga de la unidad mediante el vertido de agua purificada en el filtro del tanquel, a continuación, realice el procedimiento de inicio de enfriadores de nuevo.

4. Parada de Chiller

  1. Pulse "enter" durante aproximadamente 4 segundos.
  2. Gire el interruptor de encendido en la posición "OFF".

5. Encendido del vacío

  1. Asegúrese de que la puerta de vacío se fija en su lugar.
  2. Encienda la aspiradora 1 y 2 a los mandos de posiciones "ON".
  3. Espere hasta que el indicador de vacío VAP5 lee un nivel de vacío inferior a 1,5 mbar.

6. Detector de configuración del sistema

  1. Para configurar la presión del gas, verifique que el manómetro principal de la válvula de reducción es de al menos 10 bar.
  2. Abra la válvula principal.
  3. Abrir lentamente la válvula de presión de funcionamiento hasta que la presión alcanza 8 bar en el medidor de presión de trabajo.
  4. Abra la válvula principal Segundo
  5. Para ajustar el flujo de gas, abra la válvula de presión principal girando la perilla a la posición vertical en el panel de control de gas.
  6. Ajuste el flujo develocidad con la válvula de aguja hasta que el manómetro marque aproximadamente 8 bar.
  7. Gire el interruptor de alimentación principal a la posición "ON". La luz LED se iluminará.
  8. Para ajustar la tensión alta, activar la alta tensión girando el interruptor en la posición "ON". La luz LED se iluminará.
  9. Gire lentamente la perilla de control de voltaje de hasta aproximadamente 3.5kV se alcanza en el manómetro. NO EXCEDA 4kV.

7. Calibración

  1. Las etapas experimentales anteriores se realizan con una muestra de picos conocidos.
  2. ASA 3,3 se utiliza para obtener el gráfico de intensidad vs canal con 5 picos.
  3. Vaya a Menú → Opciones → Introducir canales y las intensidades correspondientes.
  4. Ir a ASA3 ", TPF" primera ficha.
  5. Cambiar el filtro, arriba a la izquierda 1 mm Níquel (haz filtro).
  6. Establece la posición 32.000 (rango 28.000 a 32.000, región crítica en torno a 28.000) → pasar a la posición, hacer vacío que es inferior a 5 mbar, asegúrese de que el detector se reading entre 1k-10K.
  7. Corre por 10 segundos durante aproximadamente 52 cuentas por segundo.
  8. Cambiar las ventanas de energía, (o medir la ventana de energía con la muestra solamente, sin incluir la caja del filtro). Ajuste la recta final durante 10 segundos.
  9. Encontrar la ubicación de la viga principal (233 canal, por ejemplo).
  10. Para otras carreras, cambie el filtro de nuevo en Tungsteno mm 2 (W, haz tapón) y empezar de 30.000.
  11. Encuentre la ubicación de todos los otros picos de las muestras.
  12. Use ImageJ-macro software para calibrar SAXS - hacer transiciones de intensidad vs canal de intensidad vs q (o espaciado d) (Figura 1).
  13. Use ImageJ-macro software para calibrar WAXS - hacer transiciones de intensidad vs canal de intensidad vs q (o espaciado d) (Figura 2).

8. Software Procedimiento

  1. Utilice el software ASA 3.3, para recoger los datos en vivo: Live Data TPF → → ficha Guardar archivo.
  2. Para EasySWAXS, haga clic en la ficha Configuración de dispositivo.
  3. Introduzca la "a", lambda, y valores d, así como el centro de gravedad.
  4. Seleccione Colimación Point.
  5. Seleccionar el tipo de partícula globular (a menos que sea un conocido por ser una varilla de partícula conformada plana).
  6. Haga clic en la ficha Guinier-Plot. Un I vs q 2 gráfico será mostrado.
  7. Arrastre las líneas verticales que rodean una sección de pendiente aproximadamente lineal.
  8. En la parte inferior de la pantalla, un valor de R se mostrará. Junto a esta hay un requisito de validación.
  9. Continúe arrastrando las líneas verticales más juntos hasta que el valor de validación es entre 1 y 2. Esto es subjetivo. El valor R, o radio de giro, que se obtiene es una estimación.

9. Fuente Procedimiento de apagado

  1. Verifique la seguridad y persianas rápidas están cerrados.
  2. Gire la llave de espera para la posición "ON".
  3. Espere a que la pantalla táctil para leer los niveles de reserva.
  4. Pulse R5 en el touchscreen.
  5. Reducir la corriente a 0 A.
  6. Reducir la tensión a 0 A.
  7. Gire la llave de rayos X a la posición "OFF".
  8. Encienda el interruptor principal en "OFF" presionando el botón de color rojo.

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Resultados

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SAXS y WAXS completo puede proporcionar información estructural de la muestra a través de los siguientes parámetros: el radio de giro de tamaño de partícula, y la forma, el factor de estructura de la solución, la superficie interior específica y tamaño de poro, tipo celosía y dimensión, y la densidad de electrones 1. SAXS y WAXS también puede ser aplicado al estudio de la dinámica de las proteínas 2.

La información estructural de experimentos SWAXS se obtiene por compar...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El procedimiento comparativo del sistema SWAXS permite numerosas variables que deben determinarse a partir del análisis experimental. Los parámetros que se alcanzan a partir del análisis puede ser usada para fines diferentes de acuerdo con la muestra y la configuración experimental. SAXS proporciona información acerca de nano-escala de tamaño y la forma del objeto, mientras que WAXS se centra en la estructura atómica y micro escala-(por ejemplo, red molecular, celda unidad simetría dimensión). Más específicamen...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría dar las gracias al Dr. Manfred Kriechbaum de XRS Hecus y el Instituto de Biofísica y nanosistemas Investigación de la Academia Austriaca de Ciencias en Graz, Austria. LL y XW se apoya en parte por EE.UU. Departamento de Energía, bajo NERI-C Laudo No. DE-FG07-07ID14889 y los EE.UU. Comisión de Regulación Nuclear, bajo la Donación No. NRC-38-08-950. El instrumento SWAXS también es apoyado en parte por el Departamento de Energía de EE.UU., bajo la Donación No. DE-NE0000325.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre de los productos Empresa
El System3 la Pequeña y Gran Angular-X-Ray Scattering (SWAXS) Cámara Hecus XRS y IBN,
Graz, Austria
GNOM ATSAS 2,3 paquete por D. Svergun EMBL-Hamburg

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bernadó, P., Blackledge, M. Structural biology: Proteins in dynamic equilibrium. Nature. 468, 1046-1048 (2010).
  2. Zhang, F., Skoda, M. W. A., Jacobs, R. M. J., Martin, R. A., Martin, C. M., Schreiber, F. Protein Interactions Studied by SAXS: Effect of Ionic Strength and Protein Concentration for BSA in Aqueous Solutions. J. Phys. Chem. B. 111, 251-259 (2007).
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