On-Chip fenotipificación inflamatoria endotelial

Resumen

Cámaras de flujo de microfluidos grabadas por fotolitografía y fabricada a partir de PDMS se aplican para investigar los resultados funcionales asociados con la disfunción CE y la inflamación. En un experimento representativo, la capacidad de esfuerzo cortante diferencial para modular la adhesión celular monocítica a citoquina activado monocapas CE se demuestra.

Resumen

La aterogénesis es potenciada por las alteraciones metabólicas que contribuyen a un estado de inflamación sistémica que resulta en la disfunción endotelial. Sin embargo, los primeros cambios funcionales en el endotelio que significan un nivel individual de riesgo no están directamente evaluados clínicamente para ayudar a guiar la estrategia terapéutica. Por otra parte, la regulación de la inflamación mediante la hemodinámica local contribuye a la distribución espacial no aleatoria de la aterosclerosis, pero los mecanismos son difíciles de delimitar en vivo. Se describe un enfoque basado en el laboratorio-en-un-chip a la perturbación determinar cuantitativamente metabólica de eventos inflamatorios en las células endoteliales (CE) y los monocitos bajo condiciones de flujo precisos. Los métodos estándar de la litografía blanda se utilizan para microfabricate vasculares cámaras miméticos de microfluidos (VMMC), que se enlazan directamente a los cultivos de monocapas de la CE. ¹ Estos dispositivos tienen la ventaja de utilizar pequeñas cantidades de reactivos, mientras queproporcionar una plataforma para formación de imágenes directamente los sucesos inflamatorios en la membrana de CE expuesto a un campo de cizallamiento bien definido. Se han aplicado con éxito estos dispositivos para investigar citoquinas, ^{2 lípido-3, 4} y ^RAGE-5 inducida por la inflamación en humana CE aórtico (AHCE). Aquí se documenta el uso de la VMMC a la celda de ensayo de monocítica (THP-1) a la rodadura y la detención en monocapas AHCE que están condicionados en las características diferenciales de corte y se activa por la citoquina inflamatoria TNF-α. Estudios como estos son proporcionar una visión mecanicista en atherosusceptibility en caso de factores de riesgo metabólicos.

Protocolo

1. Cultivo de células y Preparación del substrato

1. Cortar 3-pulgadas sustratos circulares de un 100 x 20 mm plato de cultivo de tejidos (BD Falcon), utilizando un torno. Esterilizar sustratos por inmersión en etanol al 70%. Colocar en un plato de Petri y la capa con 4 ml de colágeno de tipo I (100 ug / ml) durante 1 hora a temperatura ambiente, luego enjuague con 4 ml de PBS 1 x.
2. Suspender Humanos células endoteliales aórticas (AHCE, paso 4-6) en 6.5x10 ⁵ células / ml y de las semillas mediante la aplicación de 1 ml directamente sobre el sustrato. Colocar en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora y permitir que las células se adhieren al sustrato durante 1 hora.
3. Añadir 9 ml de medio de crecimiento endotelial-2 (MEG-2) suplementado con 1x antibiótico-antimicótico solución a las células. Cambiar los medios de comunicación cada 2 días hasta que las células alcanzan el 90% de confluencia.
4. Mantener células THP-1 en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% y solución 1x antibiótico-antimicótico. Pasaje de las células cuando llegan a una densidad de 10 ⁶ células / ml.

2. Protocolo de la célula Shearing

Las células son acondicionados en una costumbre de cono y placa de dispositivo de cizallamiento de la célula (CSD). Detalles de dispositivos y especificaciones de diseño se documentan en la Tabla 1 y Figura 4.

1. Preparar la CDS. Esterilizar la carcasa de una cámara con etanol y enjuagar con PBS estéril. Se calienta la vivienda a 37 ° C y nivel para asegurar que el cono es perpendicular a la monocapa de células. Montar el substrato con las células de la parte inferior de la carcasa y establecer el cono a la altura deseada.
2. Utilizar Leibovitz-15 (L-15) medio suplementado con BulletKit endotelial como el medio de cizallamiento para mantener el pH apropiado en ausencia de CO _2. Para estimular la inflamación, añadir factor de necrosis tumoral α (TNF-α, 0,5 ng / ml) al medio de cizallamiento e inyectar 6 ml en el dispositivo a través de una jeringa conectada a un puerto de entrada, teniendo cuidado de no introducir aireburbujas en la cámara.
3. Las células de corte en un esfuerzo de cizalla de magnitud constante (HSS, 15 dinas / cm ²⁾ o un esfuerzo cortante oscilatorio (OSS, 0 ± 5 dinas / cm ^2, 1 Hz) durante 4 horas. La SS deseado se consigue mediante la rotación del cono por encima de las células, que se controla con precisión con un motor de micro-paso a paso como se describió anteriormente ⁶ La SS pared en la superficie (τ _w) se aproxima por.:
   
   donde μ es la viscosidad del medio, ω es la velocidad angular del cono, y α es el ángulo de cono (0,5 °). La alineación de cono con el substrato se ajusta dentro de 0,05 ° a través de nivelación de precisión y la altura hueco fijado en 20 ± 10 micras utilizando un medidor de profundidad para minimizar la variación circunferencial y radial en τ _w. El dispositivo ha sido validada para garantizar las características de flujo laminar. Quite la canas desde el dispositivo y preparar un análisis de la adhesión de los monocitos.

3. Fabricación de PDMS de microfluidos Cámara

1. Obtener el molde maestro para el número deseado y la altura de canal de microfluidos del canal dependiendo de la aplicación. Las características del diseño específico utilizado en este protocolo se detallan en la Tabla 1. El método para la creación de estos ya está bien documentado en la literatura. ¹ Brevemente, la red de canales está diseñado utilizando software CAD (Autodesk Inventor) y se imprimen en 5000 dpi en una transparencia. Fotorresistencia negativa (SU8) se hace girar sobre una oblea de silicio a un espesor de 100 micras. La transparencia se superpone y se expone a luz ultravioleta. No polimerizado fotorresistente se elimina la generación de la maestra réplica positiva.
2. Para preparar una solución de PDMS mezcla base de silicona con silicona agente de curado de 10:1 en peso en un barco de pesar y mezclar con una pipeta serológica de 5 ml. Tenga cuidado de no raspar las paredesdel pesaje barco para evitar la adición de escamas de plástico a la solución.
3. Coloque las tabletas en un maestro de 100x15mm placa de Petri y se vierte la solución de PDMS en el plato.
4. Cubra el recipiente y colóquelo en un recipiente al vacío durante 15 minutos para eliminar las burbujas. Después de 15 minutos tomar la placa de Petri y para quitar cualquier exceso de burbujas de aire que sopla suavemente sobre la superficie.
5. Colocar la placa de Petri en un horno durante 1 hora a 70 ° C. Retirar el plato y cortar las cámaras de microfluidos con una cuchilla afilada.

4. Montaje del dispositivo en el microscopio

1. Encienda la fuente de luz para microscopio invertido y el calentador de hasta 37 º C. Fije el tubo a una jeringa de 10 ml y llenar con agua destilada tal que no hay burbujas. Coloque la jeringa en la bomba de jeringa y caudal establecido para inducir una pared de SS 1 dinas / cm ^2. La tensión de cizallamiento (τ _w) generado a lo largo de la línea central del canal se aproxima utilizando el estándarecuación para una cámara de flujo de placas paralelas:
   
   donde μ es la viscosidad del medio, Q es el caudal volumétrico, h es la altura del canal, y w es la anchura del canal. Nota: puesto que los canales son de anchura finita la real τ _w variará con w en función del canal relación de aspecto, y las mediciones se evitan en el 25% más cercana de las paredes laterales. ^1,7
2. Coloque PDMS cámara en agua y utilizar una micropipeta 100μl para eliminar el aire de los canales individuales. Conecte el adaptador de vacío a la cámara de asegurarse de que la válvula está desactivado.
3. Colocar placa de Petri con monocapa AHCE sobre el objetivo. Coloque la cámara de PDMS sobre la placa de Petri y con cuidado lo establecido en la monocapa AHCE tiempo que se garantiza que no se formen burbujas de aire entre el dispositivo y la monocapa. Gire la válvula de modo que el vacío está activado y la cámara está bien sujeto.
Cortar 19 agujas de calibre romos tal que hay sólo 5 mm de izquierda de metal. Llene el depósito de plástico con amortiguador y poner en PDMS entrada de la cámara. Repetir para el número adecuado de canales a ser utilizados. Conecte el tubo de las bombas de jeringa para que las salidas de los canales de PDMS.

5. Ensayo de adhesión de los monocitos bajo una tensión cortante

1. Suspender células THP-1 a 2x10 ⁶ células / ml en HBSS + Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} HSA + 0,1%. Activar células THP-1 por incubación con factor-1 de derivados del estroma (SDF-1, 50 mg / ml) durante 15 min a temperatura ambiente.
2. Encienda bomba de jeringa para establecer el flujo, a continuación, añadir 50 l de suspensión de células al depósito sin introducir burbujas de aire. Una vez que el flujo está totalmente desarrollado, comienzan la adquisición de datos.
3. Ejecutar durante 5 minutos a velocidad de flujo apropiado, la adición de tampón para el depósito si la solución está baja. Continúa fluyendo de búfer en los canales para vaciar las células no consolidados en la corriente de flujo.

6. Adquisición de Datos y Análisis

1. Adquirir secuencias digitales de imagen en 3 fotogramas por segundo para 2 minutos después de flujo completamente desarrollado a lo largo del eje longitudinal del canal en 3 sitios en el canal, teniendo cuidado de no grabar inmediatamente después de la entrada o antes de los puertos de salida o en el 25% más cercana al lado paredes.
2. Cuente el número de células detenidas por campo mediante la identificación de su fase brillante aparición en el mismo plano focal que la monocapa.
3. Detención Firma célula se define por el movimiento

7. Los resultados representativos

Aunque el endotelio vascular está expuesta de manera uniforme a los agonistas que contribuyen a la inflamación sistémica, la aterosclerosis es una enfermedad focal que se desarrolla preferentemente en los lugares de la perturbación del flujo en las arterias, lo que implica la heterogeneidad espacial de la función endotelial. ⁸ 9, 10 de TNF-α induce una respuesta bien caracterizado en la CE, que incluye la regulación de las moléculas de adhesión celular (CAM , por ejemplo, VCAM-1, ICAM-1, E-selectina) y quimiocinas que reclutan a los monocitos de la circulación, un sello distintivo de la lesión aterosclerótica temprana ¹¹ Hemodinámica es un importante regulador de fenotipo inflamatorio endotelial ¹² de alta tensión cortante de magnitud (HSS..; por ejemplo, 15 dinas / cm ²⁾ o el estrés de corte pulsátil (PSS, por ejemplo, 15 ± 5 dinas / cm ²⁾ asociados con los sitios de la resistencia a la aterosclerosis en las arterias descendente de TNF-α regulan las respuestas inducidas. Por el contrario, baja magnitud esfuerzo cortante (LSS, por ejemplo, 2 dinas / cm ²⁾ o de corte oscilatorio (OSS, por ejemplo, 0 ± 5 dinas / cm ^2), características de los sitios susceptibles en vivo, exacerban citocinasne inducida por la inflamación. ^{13, 14} dispositivos de microfluidos Nuestros PDMS proporcionar una plataforma para la realización de estudios sobre el mecanismo para poner a prueba hipótesis relacionadas con la superposición de estrés metabólico con factores hidrodinámicos en la regulación de la función endotelial y de la patología. La utilidad y versatilidad del método está ampliamente ilustrado a través de los siguientes resultados representativos.

Figura 1. El esfuerzo cortante diferente THP-1 modula la adhesión celular a TNF-alfa monocapas endoteliales inflamadas. Estos datos fueron adquiridos utilizando el protocolo descrito anteriormente detallada y documentada en el video. Monocapas AHCE fueron expuestas simultáneamente a una dosis baja de la citoquina inflamatoria TNF-α (0,5 ng / ml, ~ ₅₀ CE para la VCAM-1 sobre regulación) y, o bien HSS (15 dinas / cm ²⁾ o OSS (0 ± 5 dinas / cm ^2, 1 Hz) en un CSD personalizada durante 4 horas de la forma descritacama en el protocolo detallado. THP-1 detención celular se cuantificó bajo flujo cortante en una cámara de flujo de PDMS. Esta línea celular que imita el fenotipo de los monocitos humanos fue elegido por su reproducibilidad y facilidad de uso. HSS atenuada la respuesta inflamatoria en comparación con el software libre, lo que resulta en el arresto de disminución de células THP-1. Los datos fueron analizados mediante la t de Student-test y se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes. Adaptado con el permiso de DeVerse et al. ⁵

Los siguientes datos demuestran la versatilidad de nuestro enfoque, usando ejemplos de nuestro trabajo publicado. Salidas desde el protocolo anterior se indican en su caso.

Figura 2. La modulación de citoquinas inducida por la expresión de VCAM-1 y el reclutamiento de monocitos en un gradiente de esfuerzo cortante. A) monocapas AHCE fueron estimuladas con TNF-α (0,3 ng / ml) durante 4 h bajo flow en un VMMC diseñado en base a la teoría de flujo de Hele-Shaw. ¹⁵ Una disminución lineal en magnitud SS a lo largo de la línea central del canal se logra mediante el diseño de las paredes laterales de la cámara para coincidir con las líneas de corriente de un flujo de estancamiento de dos dimensiones y la configuración del extremo del canal para que coincida con las líneas de iso-potenciales. La tensión de cizallamiento (τ _w) generado a lo largo de la línea central de este canal a una distancia axial de la entrada (x) viene dada por:

donde μ es la viscosidad del medio, Q es el caudal volumétrico, h es la altura del canal, w ₁ es la anchura del canal de entrada, y L es la longitud total del canal. Q fue elegido para generar un gradiente en magnitud SS de 16 dinas / cm ² en la entrada a 0 en el punto de estancamiento ", un" justo proximal a la outlet. B)-C) VCAM-1 de expresión se midió in situ por microscopía de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos conjugados con los puntos cuánticos y presentada como la intensidad de fluorescencia porcentaje mediana (MFI) de control de unstimulated estática. SS no modular el nivel basal de VCAM-1, que es baja en AHCE no estimulada (triángulos de color gris). Sin embargo, la expresión de VCAM-1 aumentó en relación con el TNF-α en magnitudes LSS, alcanzando un máximo de ~ 2 dinas / cm ² y volver a la línea de base de TNF-α o por debajo de las magnitudes de corte> 5 dinas / cm ² (cuadrados negros). D) Los monocitos (10 ⁶ / ml) fueron perfundidos menos 2 dinas / cm ² durante 5 min en los canales de flujo paralelo sobre monocapas acondicionan previamente como en A). Reclutamiento de monocitos al endotelio cuantitativamente correlacionada con la VCAM-1 de expresión, de una magnitud dada esfuerzo cortante. En particular, la capacidad para sondear la VCAM-1 de expresión y el reclutamiento de monocitos con buena resolución espacial en una monolayeR reveló cambios significativos en un rango estrecho en magnitud SS que no se apreciará por la aplicación de sólo unos pocos valores discretos de cizallamiento en experimentos separados. Los datos fueron analizados por ANOVA de medidas repetidas y las diferencias evaluadas por Newman-Keuls post-test, * P <0,05 TNF-α en condiciones estáticas. Los datos son la media ± SEM de 3-6 experimentos independientes. Adaptado con el permiso de Zou et al. ²

Figura 3. Lipoproteínas ricas en triglicéridos (TGRL) modulan la inflamación inducida por citoquinas en proporción a los niveles de triglicéridos en suero de donantes y la expresión de VCAM-1. Monocapas AHCE fueron estimuladas con TNF-α (0,3 ng / ml) durante 4 h simultáneamente con TGRL (10 mg / dl ApoB) aisladas de seres humanos después de una comida alta en grasas en la cultura estática. A) la expresión de VCAM-1 se midió por separado en suspensión CE, por citometría de flujoy adhesión de los monocitos cuantificaron utilizando un VMMC como se describe en el protocolo detallado. Los datos se presentan como% de cambio del TNF-α. Detención monocitos varió en proporción directa a endotelial VCAM-1 de expresión, que aumentó directamente con el nivel de triglicéridos en suero de donantes. B) Monocitos detención para un subconjunto de pro-inflamatorias donantes se derogó en la presencia de un VCAM-1 anticuerpo bloqueante. La significancia fue determinado por la t de Student pareado de la prueba, media ± SEM de 3-5 experimentos independientes. Adaptado con el permiso de Wang et al. ⁴

Discusión

Se describe la utilización de dispositivos de microfluidos PDMS para la evaluación en el chip del fenotipo inflamatorio endotelial a través de la formación de imágenes en tiempo real de expresión CAM y adhesión de los monocitos. Una gran ventaja de nuestro enfoque reside en la capacidad de cuantificar los resultados asociados con la disfunción endotelial en las células expuestas a los mediadores inflamatorios como citocinas y lípidos de la dieta bajo condiciones hidrodinámicas definidos que reflejan la tensión de cizall...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Artículo	Empresa	Número de catálogo
100 x 20 mm platos de Petri	BD Falcon	353003
El etanol 95%	Merck Chemicals	EX0290-1
DPBS	Cellgro	21 a 031 CV
El colágeno tipo I Cola de Rata Derivado	Gibco	A10483-01
Las células endoteliales de aorta	Genlantis	PH30405A
Antibiótico-antimicótico solución	Invitrogen	15240-062
BulletKit endotelial	Lonza	CC-4176
Endoteliales basales medios de comunicación-2	Lonza	CC-3156
10 ml Jeringas	BD Falcon	309604
Poliuretano tubo	Tygon	ABW0001
Leibovitz, de 15 medios de comunicación	Gibco	11415-069
Sylgard 184 base de elastómero de silicona	Dow Corning	184
Sylgard 184 de elastómero de silicona Agente de Curado	Dow Corning	184
SU8 Fotoresinas Wafer Maestro	UC Davis Pan Lab	N / A
Eclipse TE200 microscopio invertido	Nikon	Eclipse TE200
Bomba de jeringa	Aparato de Harvard	PHD2000
Calibre 19 con aguja hipodérmica	Kendall	8881
THP-1 línea celular de monocitos	ATCC	TIB-202
HBSS (Hanks solución salina tamponada) con Ca 2 + / Mg 2 +	Gibco	14025-092
Factor de Necrosis Tumoral alfa (TNF-α)	R & D Systems	210-TA-010
Factor de derivados del estroma - 1 (SDF-1)	R & D Systems	350-SN-010
RPMI 1640	Cellgro	10 a 040 CV
La albúmina humana (HSA)	ZLB Behring	NDC 0053-7680-32