Summary
Utformingen av en syntetisk operon koding både sekretoriske apparat og de strukturelle monomerer med curli fibre er beskrevet. Overproduksjon av disse amyloids og vedheftende polymerer tillater en målbar gevinst adhesjon av
Abstract
Metoden beskrevet her består i å omstrukturere E. coli tilslutning egenskaper ved montering av minimum antall curli gener under kontroll av en sterk og metall-overinducible promoter, og i å visualisere og kvantifisere den resulterende gevinst på bakteriell tilslutning. Denne metoden gjelder hensiktsmessige tekniske prinsipper av abstraksjon og standardisering av syntetisk biologi, og resultater i BBa_K540000 Biobrick (Beste nye Biobrick enhet, konstruert iGEM 2011).
Det første trinnet består i utformingen av den syntetiske operon viet curli overproduksjon i respons til metall, og derfor i å øke vedheftningen evner av villtype stamme. Den opprinnelige curli operon ble endret i silico for å optimalisere transkripsjonelle og translasjonell signaler og unnslippe den "naturlige" regulering av curli. Denne tilnærmingen lov til å teste med suksess vår nåværende forståelse av curli produksjon. Moreover, forenkle curli regulering ved å bytte den endogene komplekse promoter (mer enn 10 transcriptional regulatorer identifisert) til en enkel metall-regulert promoter gjør tilslutning mye enklere å kontrollere.
Det andre trinnet omfatter kvalitativ og kvantitativ vurdering av etterlevelse evner ved gjennomføring av enkle metoder. Disse metodene anvendes for en lang rekke adherente bakterier uavhengig av biologiske strukturer som er involvert i dannelse av biofilm. Overholdelse test i 24-brønners polystyren plater gir en rask foreløpig visualisering av bakteriell biofilm etter krystallfiolett farging. Denne kvalitative testen kan slipes ved kvantifisering av hvor stor prosentandel av etterlevelse. En slik metode er meget enkel, men mer nøyaktig enn bare krystallfiolett farging som beskrevet tidligere 1 med både en god repeterbarhet og reproduserbarhet. Visualisering av GFP-merket bakterier på glassplater av fluorescens eller laser confØcal mikroskopi tillater å styrke resultatene oppnådd med den 24-brønns plate test ved direkte observasjon av fenomenet.
Introduction
Bakteriell tilslutning til abiotiske støtte spiller en stor rolle i bioremediering, Biokatalyse eller mikrobiell brenselceller. Bioremediering prosesser bruker kapasiteten til mikroorganismer å degradere organiske stoffer, eller å endre metall fordeling (immobilisering, fordampning) eller artsdannelse. Disse gunstige virksomhet blir fulgt i akvatiske og terrestriske økosystemer, men også i de kunstige systemer utviklet for å behandle forurenset vann av industrielle og innenlandske avfall. Intensiteten og kvaliteten på mikrobiell aktivitet avhenge fysikalsk-kjemiske faktorer, men også på livsstil av mikroorganismer (frittflytende eller innebygd i biofilm). Biofilmdannelse er assosiert med en metabolisme fremme resistens mot biocider ved ulike mekanismer. Dette fenomenet vil derfor bli oppmuntret i de fleste bioremediering prosesser. Videre har tekniske Escherichia coli-celler for å kontrollere dannelse av biofilm blitt brukt tilimmobilize hel-celle sensorer på biochips 2-3.
Tilpasning av mikroorganismer for høy konsentrasjon av metaller skjer via diverse mekanismer slik som adsorpsjon til ekstracellulære matriks-komponenter, aktivering av efflukspumpe eller spesifikke bærere kunne konsentrere metallet inn i cellen. Styrking disse bakterielle aktivitetene via genteknologi tillater effektiv og billig behandling av metall forurensningen på laboratorieskala, spesielt i tilfelle av svært giftige metaller i svak mengde som beskrevet av Raghu m.fl.. 2008 4. Bakteriell utbedring representerer i dette tilfellet en konkurransedyktig og kostnadsbesparende metode i forhold til klassiske kjemiske prosesser ved hjelp av ionebytterharpikser. Forfatterne beskrev en E. coli chassis genmodifisert for kobolt opptak og retensjon første ved å slå ut den efflukspumpe koding genet rcnA, og deretter ved transformasjon med en multi kopi plasmid slik overproduksjon av entransportør med fortrinnsrett opptak for kobolt. slikt stamme vises som et effektivt alternativ til ioneutvekslende å behandle radioaktive effluent, men en nøkkel uløst problem er utvinningen av forurensede bakterier ved slutten av prosessen 4. Målet med vårt arbeid har derfor vært å konstruere en spesialdesignede belastning i stand til å holde seg til abiotiske støtter som glass eller plast.
Blant hele settet av adhesiner og tilhenger fimbriae identifisert i Gram-bakterier, valgte vi å utforme et system som tillater curli produksjon. Curli er tynne (2-5 nm diameter) og svært aggregative amyloid fibre som stikker fra E. coli og Salmonella overflaten som et ikke-krystallinsk og uoppløselig matrise 5-7. Curli er også involvert i koloniseringen av abiotiske overflater og utvikling av biofilm 8. Curli ble nylig vist å binde kvikksølv ioner 9. Amyloids er faktisk kjent for å ha høyaffinitet for metallioner som Cu 2 +, Zn 2 + og Fe 3 + 10. Denne egenskapen kan ytterligere forbedre rensing av metall forurensede utslipp. CSG klyngen er ansvarlig for produksjonen av curli fibre og er konstituert av to divergently transkriberte operons (figur 1). Den csgB, csgA og csgC gener utgjør den forstand operon, koding de to curli subenheter, CsgA og CsgB. CsgC synes å være involvert i redoks aktivitet innen curli biogenesis systemet og påvirke CsgG pore oppførsel 11. Imidlertid indikerer fravær av csgC i de fleste curli-produserende bakterier som tilsvarende protein gir bare en sekundær nivå av kontroll over curli biogenesis. For å forenkle systemet, har vi blitt valgt til å jobbe med minimum antall gener.
Den csgDEFG operonencodes proteiner essensielle i reguleringen og transportav CsgA og CsgB til celleoverflaten. CsgD er en transkripsjonen aktivator av csgBAC operonen og spiller en sentral rolle i kontrollen av biofilmdannelse ved å kontrollere produksjonen av curli fimbriae og andre biofilmprosesser komponenter som cellulose 12 og ved å hemme flagellum produksjonen 13. CsgE, CsgF og CsgG utgjør en curli-spesifikk sekretoriske apparat i den ytre-membran hvorigjennom store curli subenhetsprotein CsgA utskilles som et oppløselig protein. Polymerisasjon av CsgA er avhengig i vivo på membranen-bundet nucleator proteinet CsgB (gjennomgått i 14). Komplekse regulatoriske trasé involverer flere to-komponent systemer har vist seg å kontrollere curli genekspresjon 15-16. Disse komplekse regelverk tillate bakterier å danne tykke biofilmer via curli produksjon i respons til miljømessige signaler, men er vanskelig å kontrollere for industrielle applikasjoner. For å lette utvinning av metal-fylt bakterier under en industriell prosess, må bakteriell festing til en fast bærer faktisk å bli kontrollert av veldefinert parameter (e). De adherente egenskapene curli er knyttet til deres amyloid natur 17 og kan brukes til å forbedre bioremediering prosesser, men en enklere og lett kontrollert enhet må skapes.
Blant disse 7 gener 18, et sett av 5 absolutt nødvendig gener for curli syntese (csgB og csgA koding fiber monomerer) og eksport (csgE csgF og csgG, koding av curli sekresjon komplekset) ble valgt til å konstruere den syntetiske operon. Å unnslippe "naturlige" regulering av curli, et syntetisk operon omfattende disse 5 CSG gener under kontroll av en sterk og kobolt-overinducible promotoren (figur 2) ble designet og syntetisert. Trinn-for-trinn analyse av curli-koding regionen og design prosedyre for en funksjonell synsyntetiske operon er beskrevet. To metoder for å visualisere og kvantifisere bakteriell tilslutning til isopor og glass blir forklart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biobrick Design og syntese av Curli operon
- Fastslå den genetiske organisasjonen og lokalisere de endogene transkripsjons-og translasjons-signaler av curli gener. Disse opplysninger er samlet i spesialiserte databaser som RegulonDB a eller EcoGene b og fullført av en grundig lesning av relevante publikasjoner. Data management og i silico preanalysis ble utført med Clone Manager c.
- Velg de aktuelle kodende sekvenser. Et sett av fem helt nødvendige gener for curli syntese (csgB og csgA koding fiber monomerer) og eksport (csgE csgF og csgG, koding av Curlin sekresjon komplekset) ble valgt til å konstruere den syntetiske operon. Pakk de valgte sekvensene fra datagrunnlaget i FASTA-format.
Som csgGFE klyngen er antisens i E. coli genom, konvertere denne sekvensen i sin revers supplement counterpkunst ved hjelp av Clone Manager-verktøy Operations> Process molekyl> Invert molekyl. Lim inn csgEFG sekvensen bak csgBA ved å bruke funksjonen "Ligate" (Clone> Ligate). - Legge til det aktuelle arrangøren. Ved å plassere de fem utvalgte curli gener under kontroll av arrangøren P RCN, er curli spådd å bli over-produsert i nærvær av kobolt og nikkel. Forskningsrådet locus koder en efflukspumpe ansvarlig for Ni og Co avgiftning (rcnA) og beslektet metallo-regulator (rcnR). RcnR kontrollerer ekspresjonen av rcnA og sin egen genet i respons til Ni og Co 19. Forskningsrådet sekvens bestående rcnR CDS, var hele NFR intergeniske regionen pluss de 41 første nukleotider av rcnA placedin foran csgBAEFG illusoriske sekvens (Figur 1, sekvensen av hele konstruksjonen er gitt som supplerende data).
- Optimalisere transcriptionalsignaler. En perfekt ribosombindingssetet (eller perfekt RBS = AAGGAGGTATATA) ble tilsatt i fronten av den første ATG i csgBA DNA sekvens. En andre perfekt RBS ble tilsatt foran csgEFG sekvensen. Endogen RBS for csgB og csgF og csgG gener ble bevart.
- Å passe iGEM standarder, må enheten være flankert av en standard BioBrick prefiks og suffiks, som inneholder restriksjonsseter for EcoRI, Pst I (prefiks) og Spe jeg og Xbal (suffiks). Lim tilsvarende sekvenser i hver ende av enheten d.
- Eliminere eventuelle EcoRI, PstI, Spe jeg og Xbal anerkjennelse stedet, i enheten. Å lette videre monteringen prosessen kan BioBrick delen selv ikke inneholde noen av disse restriksjonsseter. I silico begrensning analyse av enheten avslørte en PstI nettstedet i csgA sekvensen, en PstI nettstedet i rcnR sekvensenog en EcoRI-sete i den csgE genet. Disse nettstedene er henholdsvis ligger i posisjon 80 (Mut1), 1340 (Mut2) og 1830 (Mut3) på enheten sekvens (supplerende data) og ble endret som følge av tause mutasjoner.
Mut1 PstI nettstedet CTGCAG endret i CGTCTG
Mut2 PstI nettstedet CTGCAG endret i CAGCAG
Mut3 EcoRI GAATTC endret i GAATT - Kjør gjennom oversettelsen simulering ved hjelp av Clone Manager-programvare (Operation> Prosess molekyler> Oversett molekyler). Bruk flersekvenssammenstillingen programmet BLAST å verifisere perfekte homologi mellom villtype curli protein og proteiner kodet av den syntetiske operon.
- Bestille syntetisk operon. Kommersielle genet syntese tjenester er tilgjengelig fra en rekke selskaper over hele verden, var vår partner Genecust (Luxembourg). 4 mikrogram av den kunstige operon (3165 bp) ble mottatt noen uker senere og satt inn pUC57 (pIG2).
2. Visualisere og kvantifisere tilhenger Bakterier på Isopor
- Fyll hver brønn av en 24-brønners polystyren plate med 2 ml M63 minimalt medium (glukose 0,2%) og inokuler hver brønn med 106 celler av en over natten kultur. Vokse bakterier ved 30 ° C i 18 til 48 timer uten risting. Hver kolonne (4 brønner) representerer en modalitet. Tilfør riktig mengde av kobolt (25 til 100 mM) og antibiotika (ampicillin 100 μg.L -1) ved behov. De tre første radene i 24-brønners plate brukes til å kvantifisere de adherente bakterier ved gjennomsnitt de 3 repetisjoner, er den siste raden venstre brukes til å visualisere biofilm.
- For de tre første radene i 24-brønners plate: for hver brønn, gjenopprette supernatanten inneholder planktoniske celler.
- Nøye skyll hver brønn med 1 ml M63 og basseng 1 ml vask med den innledende supernatanten erholdt i 2.2). Dette bassenget kalles svømming celler (= S).
- Gjenopprette biofilm i 1 ml of M63 ved skraping og pipettering opp og ned (= B). Vortex 15 sek. Beregne antall overflate-tilkoblede og svømming bakterier fra den optiske densitet ved 600 nm (OD600) for å gi tilslutning prosentandelen tilsvarer hvert modalitet.
- Prosentandelen av etterlevelse er beregnet ved hjelp av formelen: BX100 / (3xs + B).
- Bare for den siste raden i 24-brønners plate: kast planktoniske celler.
- Skyll med 1 ml M63 biofilm som hadde utviklet på bunnen av platen.
- Tørk den åpne plate i 1 time ved 80 ° C.
- Legg 100 pl 20% krystallfiolett i 2 min i hver brønn etterfulgt av omfattende vaskinger med vann for å visualisere overflate-tilkoblede bakterier.
Tre uavhengige analyser (plater) må utføres for å sikre reproduserbarhet.
3. Visualisere tilhenger Bakterier på Glass ved mikroskopi
- Få et fluoriserende chassis. E. coli SCC1 e belastning som constitutively uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) uten observerbar forskjell fra den overordnede belastningen MG1655 20 er en passende vert for plasmid peiling syntetisk curli operon.
- Transform SCC1 med pIG2 plasmid (= syntetisk curli operonen inn ved EcoRI / PstI området av pUC57-plasmidet) for å oppnå S23 belastningen. Transform SCC1 med en kontroll-plasmid (pUC18) for å oppnå kontroll stamme S24 21.
- Vokse over natten precultures av S23 og for kontrollen (S24) stammer ved 30 ° C i M63-medium supplert med glukose (0,2%) og ampicillin (100 μg.L -1).
- Inokuler 15 ml av det samme medium i petriskåler med 100 ul av den precultures. Legge til passende konsentrasjon av kobolt (dvs. 25 mikrometer), og ikke glem den negative kontrollen uten kobolt. Introduser 3 rektangulær glass dekkglass i hver petriskål. Inkuber over natten ved 30 ° C uten risting.
- Fjern dekkglasset from petriskål og nøye tappe det. Rengjør nedre ansikt med en liten bomull ting impregnert med 70 ° etanol ved å tørke av hver bakteriell rester. For confocal observasjon, rengjøre både øvre endene på noen få millimeter for å tillate ytterligere fiksering av dekkglasset.
- Adherente bakterier kan visualiseres direkte, men raskt under fluorescensmikroskop men nøye unngå tørking av prøven.
- For confocal observasjon, sette dekkglass på et glass lysbilde med den øvre ansiktet dekket av biofilm plasseres med forsiden opp. Biofilm blir så dekket med et større dekkglass, som er festet til glass-slide med lakk. Inverter oppsettet slik at biofilm vil nå være på undersiden.
- Plasser oppsettet under confocal laser mikroskop. En rett Axioplan2 LSM510 (Zeiss) confocal laser mikroskop ble brukt på Platim plattformen f.
- Stille. Excite GFP ved 488 nm, og samle det bakterielle fluorescens i området 500-600 nm . Bruk 40x neddyppingsobjektivet for å anskaffe bilder i laserskanning confocal modus. Skann samlede tredimensjonale strukturer av biofilm fra den faste overflate i grensesnittet med vekstmediet ved hjelp av en trinn 1 mikrometer.
- Utfør tredimensjonale projeksjoner med IMARIS programvare (Bitplane, Zürich, Sveits). Bestem biofilm tykkelse ved analysen av den gjennomsnittlige z verdi langs statistiske langsgående seksjoner. Kvantifisering av biofilm biovolumes kan utvinnes fra confocal z-stabler som beskrevet andre steder 22.
en RegulonDB gir mekanistisk informasjon om operon organisasjon og deres nedbrytning transkripsjon enheter, arrangører og deres sigma type, gener og deres ribosombindingssetet områder, terminatorer, bindingsseter av spesifikke transcriptional regulatorer, samt deres organisasjon til regulatoriske setninger.et = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp
b EcoGene databasen inneholder oppdatert informasjon om E. coli K-12 genomet og proteom sekvenser, inkludert omfattende genet bibliografier. En stor EcoGene fokus har vært re-evaluering av oversettelse start nettsteder. http://ecogene.org/
c http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm
d http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix
e Gift of Chun Chau Sze, Nan Yang Technical University, Singapore.
f Platim mikroskopisk plattform UMS3444 biovitenskap Gerland - Lyon Sud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I silico annotering av villtype CSG sekvens av E. coli K12 knyttet optimalisering av transkripsjons-og translasjons-signaler har tillatt å utforme den enkle syntetiske curli operonen P RCN-CSG vist i figur 3 (full sekvens i utfyllende data). Protokoll 2 og protokoll 3 ble brukt til å visualisere og kvantifisere tilslutning forbundet med curli produksjon. Bruke krystallfiolett flekker på 24-brønners polystyren plater (protocole 2) biofilmdannelse nederst fra hver brønn kan bli raskt visualisert og det ser ut til at villtype belastningen er mindre vedheftende enn konstruert belastningen som vist ved forskjellen i lilla fargeintensitet (Figur 4A). Dette kvalitativ tilnærming er styrket ved kvantitativ måling som viser at andelen av etterlevelse er 1,5 ganger høyere i den utviklet stamme (figur 4B). Videre, nøyaktigheten av quantita ning tillater måling av en betydelig forsterkning av tilslutning i nærvær av økende konsentrasjoner av kobolt. Faktisk, i media med kobolt konsentrasjoner av 0 uM, 25 uM eller 50 uM, prosenter av adherente celler på 25%, 30% og 40% henholdsvis (figur 4B). Etterlevelse evner kan også sammenlignes med mikroskopi med GFP-merket bakterier dyrket på glassplater. Epifluorescence mikroskopi observasjoner (grønne bakterier på svart bakgrunn) avslører at den utviklet belastningen danner en flere lag stort aggregat betraktes som en biofilm mens villtype stammen danner kun mikro-kolonier (figur 5). Konfokalmikroskopi analyse gir en samlet oversikt over biofilm tredimensjonal struktur og bekrefter at den utviklet belastningen er mer tilhenger, danner en tettere og tykkere biofilm (figur 6).
4176fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/>
Figur 1. Curli villtype system. Curli er laget av to monomerer kodet av csgB og csgA gener. Takket være deres signal peptid, er CsgA og CsgB curli monomerer translocated over cytoplasmisk membranen via Sec-systemet. En spesifikk maskiner består av tre hovedkomponenter, nemlig CsgE, CsgF og CsgG tillater translokasjon av curli monomerer over den ytre membran.
Figur 2. En sterk og kobolt induserbar-promoter (BBa_K540001). Promotoren P rcnA styres av den transkripsjonelle repressor RcnR. Den rcnR genet er transkribert fra sin endogen promoter P rcnR, divergently fra P rcnA. Tilstedeværelsen av rcnR genet sikrer en korrekt forhold mellom repressor kopier versus P rcnA regulatoriskeregion. I fravær av kobolt, binder RcnR til RcnR boksen på DNA og forhindrer full transcriptional aktivering av nedstrøms gener. Hvis den intracellulære konsentrasjonen av kobolt stiger, hindrer binding av kobolt til RcnR proteinet fiksering av repressor til promotoren og den transkripsjonelle aktivitet av PrcnA øker 19.
Figur 3. Den syntetiske curli operon. Curli gener er plassert under kontroll av P rcnA. Den rcnR genet uttrykt fra sin egen promotor skal gi nok repressor å kontrollere ekspresjon av curli gener i en kobolt avhengig måte. Å unngå periplasmiske trafikkork grunnet curli monomer overproduksjon (CsgB og CsgA), komponentene i curli spesifikke sekresjon apparat (CsgE, CsgF og CsgG) må overprodusert også. Lagt traductional signaler er i dicated i grå (RBS = Perfekt RBS). E = EcoRI X = XbaI S = Sph I P = Pst I. Denne syntetiske delen kalt Bba_K540000 lar konstruert belastning å bli vedheftende til glass, sand eller plast via curli overproduksjon.
Figur 4. Visualisering og kvantifisering av klebrige bakterier på 24-brønners polystyren plate. A. Krystallfiolett farget biofilm dannet av adherente bakterier på polystyren. B. Andel tilslutning på polystyren av vill type og de konstruerte stammer med forskjellige konsentrasjoner av kobolt. Statistiske forskjeller mellom behandlinger er angitt med små bokstaver (variansanalyse og Fishers minst signifikant forskjell test, P <0,05).
76/4176fig5.jpg "alt =" Figur 5 "/>
Figur 5. Epifluorescence mikroskopi bilder av tilhenger GFP-merket bakterier på glassplater. Bakterier er grønn på sort bakgrunn. Pilene peker på microcolonies.
Figur 6. Confocal microscropy assistert tredimensjonale rekonstruksjoner av biofilm struktur på glassplater: A. Top view rekonstruksjoner B. Side view rekonstruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinn
Den mest kritiske trinn i denne syntetiske biologi tilnærming er genet motivet. Syntetisk gen design har å være grundig for å sikre et effektivt system produksjon. To gener som koder for fiber monomerer og tre gener som koder for proteiner involvert i deres sekresjon system er satt sammen med en sterk og metall-induserbar promoter å opprette en ny funksjonell enhet for en ny anvendelse: bio-rensing av kjernefysisk avløp. Som planlagt og spådd, fører denne enheten til en forbedret høy curli produksjon, som er forsterket ved å øke mengden av kobolt i mediet. Slik suksess resultater fra tilstedeværelsen av både de egnede transkripsjonelle signaler i valgte promoter (P rcnA), og de effektive translasjonelle signaler legges foran hvert sett av curli gener (csgBA og csgEFG) (se figur 3). I tillegg, når du arbeider med en multicopy plasmid, oppmerksomhet må betales til kopien antall regulatoren (e) som er involvert i promoter kontroll. Her, ble multicopies av hovedregulatoren RcnR av den brukte promotoren (P rcnA) tilgjengelig fra samme plasmid (figur 3).
Begrensninger, mulige endringer
Å sikre en perfekt reproductibility har tilslutning alltid testen som skal utføres i den samme type polystyren plater (se tabell). Fluorescensmikroskopi er enklere med fluorescerende-merket stammer, men dette kravet kan overvinnes ved hjelp av fluorescerende fargestoffer som Syto eller plasmid som bærer lac-GFP fusjoner 23. Bakteriell vedlegg til abiotiske overflater som polystyren og glass avhenger ionestyrken eller osmolariteten av mediet. Best resultater oppnås vanligvis i minimalt medium eller fortynnet LB 22, 24.
Fremtidige søknader eller retninger etter mestre denne teknikken
innhold "> Metoden beskrevet her for å kvantifisere bakteriell tilslutning er rask og billig. imidlertid å karakterisere et stort antall stammer eller kultur betingelser, og / eller for å få en detaljert strukturell karakterisering av biofilm, høy gjennomstrømning metode basert på konfokal laser scanning mikroskopi kombinert med bruk av 96-brønners mikrotiterplater må vurderes 25.Den MBEC avskjermingssystem, tidligere Calgary Biofilm Device 26 kan også brukes. Dette systemet er basert på bruken av en mikrotiterplate med et avtakbart lokk som holder 96 tappene undergrunnen slik mikroskopiske observasjoner av biofilm struktur 27, eller kvantifisering av celler i biofilm etter avbrudd ved sonikering på et vannbord sonikator (The MBEC Internett-gjennomløp ( HTP) Assay, Innovotech, Edmonton, Canada). Et annet system, biofilm Ring Test, overvåker hvor inerte paramagnetiske perler inngår i dyrkningsmediet blir immobilisert under dannelseav biofilmen 28, og kan brukes til å kvantifisere biofilmdannelse. MBEC og Biofilm Ring Test krever spesifikke materialer som er dyrere enn grunnleggende forbruksvarer brukt i denne studien.
Betydningen av teknikken med hensyn til eksisterende metoder
Å skape et enkelt uavhengig curli operon, prøvde vi to metoder parallelt: en syntetisk tilnærming beskrevet her, og en klassisk metode som involverer mutagenese å fjerne intern EcoRI og PstI restriksjonsseter, og PCR trinn etterfulgt av ligations. Begge tilnærminger ble initiert på samme tid, men sekvensering analyse av operon erholdt ved den klassiske metoden avslørte uønskede mutasjoner. Derfor, har syntesen av enheten vært mer effektiv og raskere enn klassisk kloning og mutagenese prosedyrer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker andre medlemmer av Lyon INSA-ENS iGEM team (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre DUPREY, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon og Valérie Desjardin), våre sponsorer for deres økonomiske støtte (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon og Institutt for biovitenskap INSA-Lyon), F. Wisniewski-dye for kritisk lesning av dette manuskriptet og Dr CC Sze for belastning gave. B. Drogue mottar en doktorgrad fellesskapet fra Région Rhône-Alpes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn-csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
References
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S.
- Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
- Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
- Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
- Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
- Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
- Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
- Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
- Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
- Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
- Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
- Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
- Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
- Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
- Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
- Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
- Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
- Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
- Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. Biological Adhesives. Callow,, J., Smith, A. M. , Springer-Verlag. (2006).
- Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
- Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
- Miller, J. E. Experiments in molecular genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).
